Assay der Legionella pneumophila-Replikation in Makrophagen, die mit äußeren Membranvesikeln vorbehandelt wurden

Beginnen Sie mit einer Multi-Well-Platte mit vorbehandelten Makrophagen, die bakteriellen Legionella pneumophila, Vesikeln der Außenmembran (OMVs) ausgesetzt waren.

Legionella pneumophila wird in einem definierten Bakterium-Wirtszell-Verhältnis zugegeben, um die OMV-behandelten Makrophagen zu infizieren.

Während der Inkubation internalisieren die Makrophagen die Bakterien in membrangebundenen Phagosomen.

Die OMV-Vorbehandlung verändert die Makrophagen-Signalgebung und hemmt die Reifung der Phagosomen.

Dies erleichtert die Bildung einer Legionellen-haltigen Vakuole, die die Bakterien schützt und die intrazelluläre Replikation ermöglicht.

Fügen Sie ein Reinigungsmittel hinzu und inkubieren Sie, um die Makrophagen zu lysieren. Dadurch werden die intrazellulären Bakterien an das Medium abgegeben.

Streichen Sie das verdünnte Lysat auf eine mit Nährstoffen angereicherte Agarplatte.

Während der Inkubation wachsen die Bakterien und bilden sichtbare Kolonien.

Zählen Sie die Kolonien, um die koloniebildenden Einheiten (KBE) zu bestimmen, die die Anzahl lebensfähiger Bakterien darstellen.

Vergleichen Sie die KBE-Zahlen zwischen OMV-behandelten und unbehandelten Makrophagen.

Eine höhere KBE bei OMV-behandelten Makrophagen im Vergleich zu unbehandelten Makrophagen deutet darauf hin, dass OMVs das Überleben von Legionellen in den Makrophagen erleichtern.

Zur Infektion von vorbehandelten oder unbehandelten THP-1-Zellen mit Wildtyp-L.pneumophila-Stamm Core B oder murinen BMDM-Zellen mit einer flagellenlosen Mutante dieses Stammes, ohne das Medium von den Zellen zu verändern.

Fügen Sie Bakterien mit einem MOI von 0,5 hinzu, was eins mal 10 bis zur fünften L.pneumophila pro Vertiefung entspricht. Inkubieren Sie die Kulturen für 24 bzw. 48 Stunden. Um die Zellen zu lysieren, fügen Sie Saponin in einer Endkonzentration von 0,1 % hinzu und inkubieren Sie die Zellen fünf Minuten lang.

Streichen Sie dann 50 Mikroliter der erforderlichen Verdünnungen auf BCYE-Agarplatten und inkubieren Sie die Platten drei Tage lang.

Zählen Sie die gebildeten Kolonien visuell mit dem Auge und führen Sie Berechnungen gemäß dem Textprotokoll durch.