Ein Verfahren zur Bakterienernte und mechanischen Lyse
JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiologie
0 Ansichten • 3:12 Min. • August 29th, 2025
Nehmen Sie eine Kultur von Staphylococcus aureus, einem Bakterium mit einer dicken Peptidoglykan-Zellwand.
Verdünnen Sie die Kultur in frischen Medien, die Antibiotika enthalten, und inkubieren Sie sie bei warmer Temperatur unter Schütteln, um das Bakterienwachstum zu fördern.
Übertragen Sie die Kultur in ein Röhrchen und zentrifugieren Sie sie, um die Bakterien zu pelletieren.
Entsorgen Sie den Überstand und legen Sie das Pellet auf Eis, um die Bakterien vor Schäden zu schützen.
Resuspendieren Sie das Pellet in Lysepuffer und geben Sie es in ein Röhrchen mit Kieselsäurekügelchen.
Führen Sie das Röhrchen in ein mechanisches Zelllyseinstrument ein und leiten Sie das Rühren ein.
Schnelle Kollisionen zwischen den Bakterien und den Kügelchen erzeugen Scherkräfte. Dabei werden die Bakterien lysiert, wobei DNA, RNA und RNA-Protein-Komplexe freigesetzt werden.
Ionen im Lysepuffer stabilisieren RNA-Strukturen, während Reduktionsmittel im Puffer RNA-abbauende Enzyme inaktivieren.
Zentrifugieren Sie nun die Mischung erneut, um die Ablagerungen zu pelletieren.
Sammeln Sie den Überstand mit Nukleinsäuren und Proteinen für die weitere Analyse.
Züchten Sie eine Kolonie von Stämmen, die entweder pCN51 P3 MS2 sRNA oder pCN51 P3 MS2 Plasmide in drei Millilitern BHI-Medium enthalten, ergänzt mit 10 Mikrogramm Erythromycin pro Mikroliter in Duplikaten.
Verdünnen Sie jede Übernachtkultur in 50 Millilitern frischem BHI-Medium, das mit Erythromycin ergänzt wird, um einen OD 600 von 0,05 zu erreichen. Züchten Sie die Kulturen bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie sie sechs Stunden lang bei 180 U/min. Übertragen Sie jede Kultur in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 2.900 G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius, entsorgen Sie dann den Überstand, frieren Sie sie ein und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius oder halten Sie die Pellets auf Eis und führen Sie direkt eine mechanische Zelllyse durch.
Um eine mechanische Zelllyse durchzuführen, werden die Pellets in fünf Millilitern Puffer A resuspendiert und die resuspendierten Zellen in 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit 3,5 Gramm Siliziumdioxidkügelchen überführt. Führen Sie die Röhrchen in ein mechanisches Zelllyseinstrument ein und führen Sie einen Zyklus von 40 Sekunden mit vier Metern pro Sekunde durch. Zentrifugieren Sie die Röhrchen 15 Minuten lang bei 2.900 mal G, gewinnen Sie dann den Überstand und halten Sie ihn auf Eis.
Vergewissern Sie sich, dass der Überstand klar ist, und wiederholen Sie die Zentrifugation, wenn dies nicht der Fall ist.
Übersicht
In diesem Artikel wird ein Protokoll zur Lyse von Staphylococcus aureus zur Gewinnung von Nukleinsäuren und Proteinen beschrieben. Die Methode umfasst die mechanische Zelllyse mithilfe von Kieselglasperlen und anschließende Zentrifugation zur Isolierung der gewünschten Bestandteile.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Mikrobiologie
- Molekularbiologie
- Zellbiologie
Hintergrund
- Staphylococcus aureus ist ein Bakterium, das für seine dicke Peptidoglykanschicht bekannt ist.
- Das Verständnis seiner zellulären Bestandteile ist entscheidend für verschiedene biologische Untersuchungen.
- Die mechanische Lyse ist eine wirksame Methode zur Gewinnung von Nukleinsäuren und Proteinen.
- Eine sachgemäße Handhabung und Verarbeitung der Proben ist erforderlich, um die Integrität der Biomoleküle zu bewahren.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer zuverlässigen Methode zur Lyse von Staphylococcus aureus.
- Extraktion von DNA, RNA und Proteinen zur weiteren Analyse.
- Vorlage eines detaillierten Protokolls, das in Forschungseinrichtungen reproduziert werden kann.
Verwendete Methoden
- Kultivierung von Staphylococcus aureus in antibiotikahaltigem Medium.
- Zentrifugation zur Pellettierung der Bakterien und Entsorgung des Überstandes.
- Mechanische Lyse mithilfe von Silikakügelchen und einem Zelllysegerät.
- Isolierung von Nukleinsäuren und Proteinen durch Zentrifugation.
Hauptergebnisse
- Eine erfolgreiche Lyse von Staphylococcus aureus wurde erreicht.
- Die isolierten Nukleinsäuren und Proteine eigneten sich für weitere Analysen.
- Die Methode zeigte Reproduzierbarkeit über verschiedene Kulturen hinweg.
- Ein klarer Überstand wurde für nachgeschaltete Anwendungen gewonnen.
Schlussfolgerungen
- Die mechanische Lysemethode ist wirksam zur Gewinnung zellulärer Bestandteile aus Staphylococcus aureus.
- Dieses Protokoll kann in verschiedenen mikrobiologischen und molekularbiologischen Studien angewendet werden.
- Zukünftige Anwendungen könnten Studien zur Genexpression und zu Proteinwechselwirkungen umfassen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die mechanische Lyse von grampositiven Bakterien ermöglicht die zuverlässige Extraktion von Nukleinsäuren und Proteinen für nachgeschaltete molekularbiologische Analysen. Diese Methode unterstützt die Zielvalidierung und Assay-Entwicklung, indem sie hochwertige Biomaterialien aus klinisch relevanten Stämmen bereitstellt. Sie behebt einen zentralen Engpass in der präklinischen Forschung, bei dem eine robuste Probenvorbereitung für Mechanismus-basierte Entschärfung und Workflows zur Identifizierung von Leitverbindungen unerlässlich ist.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch den Zugang zu intrazellulären Nukleinsäuren und Protein-Komplexen.
- Operationaler Wert: Bietet reproduzierbare Probenvorbereitung zur funktionellen Zielstruktur-Validierung bei grampositiven Pathogenen.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem konsistentes Biomaterial für Wirkmechanismus-Studien bereitgestellt wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Liefert gereinigte DNA, RNA und RNA-Protein-Komplexe, die für die Entwicklung quantitativer Assays geeignet sind.
- Operativer Wert: Gewährleistet die Standardisierung von Assays durch kontrollierte Lyseparameter und kugelbasierte Zellzerstörung.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die Herstellung validierter biologischer Systeme für Hochdurchsatz-Screening-Kampagnen.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verbindet frühe Entdeckungen mit der präklinischen Validierung durch zuverlässige Gewinnung krankheitsrelevanter Biomoleküle.
- Mechanistische Entlastung: Verringert die Unsicherheit bei Target-Engagement-Studien, indem native RNA-Protein-Interaktionen erhalten bleiben.
- Biomarker-Ausrichtung: Ermöglicht den Nachweis translationsrelevanter Biomarker durch die intakte Rückgewinnung von Nukleinsäuren.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der frühen Biologie bis zur Identifizierung von Leitstrukturen ein und liefert einen standardisierten Input für Omics- und Interaktionsstudien.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen durch Freisetzung intrazellulärer Komponenten zur Analyse.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft für Assays durch reproduzierbares Lyseverfahren und klare Gewinnung des Überstandes.
- Analytik: Liefert quantitative Messungen von Nukleinsäuren und Proteinen zur Bewertung vergleichender Bedingungen.
- Translationale Forschung: Bindet an präklinische Arbeitsabläufe an, indem die Integrität von RNA und Protein-Komplexen erhalten bleibt.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als wiederverwendbare Plattform für die Probenvorbereitung in mehreren Studien an grampositiven Stämmen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit bei der Zielvalidierung durch konsistente Gewinnung von Biomolekülen.
- Operativer Wert: Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit der Zelllyse über Chargen hinweg.
- Strategischer Wert: Verbesserte Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch von Projekten durch Verringerung der biologischen Variabilität in der Probenvorbereitung.
- Portfolio-Implikation: Risikoadjustierte Priorisierung basierend auf verlässlichen molekularen Daten aus lysierten Kulturen.
Durchführungsüberlegungen
- Benötigt Fachkenntnisse in mikrobiologischer Kultur und aseptischer Handhabung.
- Hängt von mechanischen Zelllysegeräten und kompatiblen Gefäßen/Adaptern ab.
- Erfordert die Standardisierung der Zusammensetzung des Lysepuffers und der Menge an Glasperlen.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen hinsichtlich der variierenden Dicke der Zellwände grampositiver Bakterien.
- Umfasst praktische Einschränkungen, wie beispielsweise die Wärmeentwicklung während der Lyse, die eine Temperaturkontrolle notwendig macht.
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Zuletzt aktualisiert: 29 August 2026