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Mikrobiologie
0 Aufrufe • 2:30 Min. • August 29th, 2025
Nehmen wir ein bakterielles Zelllysat, das zelluläre Komponenten enthält, einschließlich MS2-markierter sRNA, die an ihre Ziel-RNA gebunden ist.
MS2-markierte sRNA ist eine technisch hergestellte kleine regulatorische RNA, die an ihrem 5'-Ende eine MS2-Aptamer-Stammschleife trägt, die eine hohe Affinität zum MS2-Virushüllprotein aufweist.
Das bakterielle Lysat wird auf eine präequilibrierte Affinitätschromatographiesäule übertragen, die Amyloseharz enthält, das an Fusionsproteine gebunden ist, die aus dem Maltose-bindenden Protein (MBP) und dem MS2-Hüllprotein bestehen.
Das immobilisierte MS2-Hüllprotein fängt spezifisch die Aptamer-Stammschleife der MS2-markierten sRNA ein und behält die intakte Ziel-RNA-gebundene sRNA bei.
Nicht markierte Moleküle, die ungebunden bleiben, werden im Durchfluss gesammelt.
Waschen Sie die Säule mit Puffer, um verbleibende ungebundene Moleküle zu entfernen.
Eluieren Sie mit einem Puffer, der Maltose enthält, das MBP aus dem Harz verdrängt und die MS2-markierte sRNA freisetzt, die an ihre Ziel-RNA gebunden ist.
Sammeln und lagern Sie die Fraktionen auf Eis, um die RNA-Integrität für die nachgelagerte Analyse zu erhalten.
Entfernen Sie die Säulenspitze, legen Sie dann eine Chromatographiesäule in ein Säulengestell und waschen Sie die Säule mit Reinstwasser. Fügen Sie 300 Mikroliter Amyloseharz hinzu und waschen Sie die Säule mit 10 Millilitern Puffer A. Verdünnen Sie 1.200 Picamole des Proteins MBP-MS2 in sechs Millilitern Puffer A und laden Sie es in die Säule.
Waschen Sie die Säule mit 10 Millilitern Puffer A.Führen Sie anschließend eine MS2-Affinitätsreinigung durch. Laden Sie das Zelllysat in die Säule und sammeln Sie die Durchflussfraktion in einem sauberen Sammelröhrchen. Waschen Sie die Säule dreimal mit 10 Millilitern Puffer A und sammeln Sie die Waschfraktion, eluieren Sie dann die Säule mit einem Milliliter Puffer E und sammeln Sie die Elutionsfraktion in einem zwei Milliliter Mikroröhrchen.
Bewahren Sie alle gesammelten Fraktionen bis zur RNA-Extraktion auf Eis auf.