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Mikrobiologie
0 Aufrufe • 2:30 Min. • August 29th, 2025
Nehmen wir ein bakterielles Zelllysat, das zelluläre Komponenten enthält, einschließlich MS2-markierter sRNA, die an ihre Ziel-RNA gebunden ist.
MS2-markierte sRNA ist eine technisch hergestellte kleine regulatorische RNA, die an ihrem 5'-Ende eine MS2-Aptamer-Stammschleife trägt, die eine hohe Affinität zum MS2-Virushüllprotein aufweist.
Das bakterielle Lysat wird auf eine präequilibrierte Affinitätschromatographiesäule übertragen, die Amyloseharz enthält, das an Fusionsproteine gebunden ist, die aus dem Maltose-bindenden Protein (MBP) und dem MS2-Hüllprotein bestehen.
Das immobilisierte MS2-Hüllprotein fängt spezifisch die Aptamer-Stammschleife der MS2-markierten sRNA ein und behält die intakte Ziel-RNA-gebundene sRNA bei.
Nicht markierte Moleküle, die ungebunden bleiben, werden im Durchfluss gesammelt.
Waschen Sie die Säule mit Puffer, um verbleibende ungebundene Moleküle zu entfernen.
Eluieren Sie mit einem Puffer, der Maltose enthält, das MBP aus dem Harz verdrängt und die MS2-markierte sRNA freisetzt, die an ihre Ziel-RNA gebunden ist.
Sammeln und lagern Sie die Fraktionen auf Eis, um die RNA-Integrität für die nachgelagerte Analyse zu erhalten.
Entfernen Sie die Säulenspitze, legen
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