Nanopartikel-vermittelte Visualisierung des endo-lysosomalen Umbaus in bakteriell infizierten Zellen

Nehmen Sie einen Objektträger mit Kammer, der menschliche Epithelzellen mit fluoreszenzmarkierten Endosomen enthält.

Intrazelluläre pathogene Bakterien einführen und inkubieren, damit sie an den Zellen haften können.

Die Bakterien injizieren Proteine, die das Zytoskelett des Wirts reorganisieren und Membranvorsprünge bilden, die die Bakterien in Vakuolen internalisieren.

Diese Vakuolen verlängern die röhrenförmigen Projektionen, die mit dem endo-lysosomalen System verbunden sind, einem Netzwerk von Vesikeln und Organellen, die den intrazellulären Transport regulieren.

Diese Projektionen lenken den Vesikeltransport um und bauen das endolysosomale System um.

Waschen, um extrazelluläre Bakterien zu entfernen, dann mit einem antibiotikahaltigen Medium inkubieren, um alle verbleibenden Bakterien zu eliminieren.

Ersetzen Sie es durch ein serumfreies Bildgebungsmedium, das das Antibiotikum enthält, und fügen Sie Nanopartikel hinzu, die mit einem kontrastierenden Fluorophor markiert sind.

Inkubieren, um den Eintritt von Nanopartikeln über Endozytose und die Akkumulation in den umgebauten Vesikeln zu ermöglichen.

Waschen, um nicht internalisierte Nanopartikel zu entfernen, und dann in einem mit Serum angereicherten Bildgebungsmedium inkubieren.

Die fluoreszierenden Nanopartikel und markierten Endosomen ermöglichen die Visualisierung des bakterieninduzierten endo-lysosomalen Umbaus.

Um dieses Verfahren zu beginnen, messen Sie den OD 600 der subkultivierten Bakterien und verdünnen Sie ihn auf einen OD 600 von 0,2 in einem Milliliter PBS, fügen Sie den HeLa-Zellen im 8-Well-Kammer-Objektträger geeignete Mengen an Bakterien hinzu, um eine Infektionsmultiplizität von 100 zu erreichen. 30 Minuten im Zellinkubator inkubieren.

Waschen Sie die HeLa-Zellen dreimal mit PBS, um nicht internalisierte Bakterien zu entfernen. Dieser Zeitpunkt wird als null Stunde nach der Infektion oder null Stunde p.i. festgelegt. Geben Sie 300 Mikroliter frisches Kulturmedium mit 100 Mikrogramm Gentamicin pro Milliliter zu den Zellen und halten Sie es eine Stunde lang aufrecht.

Ersetzen Sie das Medium nach einer Stunde durch ein bildgebendes Medium, das 10 Mikrogramm pro Milliliter Gentamicin enthält. Fügen Sie den HeLa-Zellen Gold-BSA-Rhodamin-NPs hinzu, um eine Endkonzentration von OD 520 von 0,1 zu erhalten.

Eine Stunde lang inkubieren. Entfernen Sie nach einer Stunde das Medium und waschen Sie es dreimal mit PBS. Zum Schluss fügen Sie für den Rest der Inkubationszeit 300 Mikroliter frisches Bildgebungsmedium mit 10 Prozent FCS und 10 Mikrogramm pro Milliliter Gentamicin hinzu.