Kultivierung von Mycobacterium tuberculosis unter eisenbeschränkten Bedingungen

Beginnen Sie mit einer Agarplatte, die Mycobacterium tuberculosis-Kolonien enthält, die auf einem nährstoffangereicherten Medium gezüchtet wurden.

Impfen Sie ein einzelnes Volk in eine nährstoffhaltige Brühe und brüten Sie es unter Rührwerk für ein gleichmäßiges Wachstum.

Lassen Sie die Kultur die späte logarithmische Phase erreichen, in der die Zellen metabolisch aktiv sind.

Pipettieren Sie ein kleines Volumen auf eine angereicherte Agarplatte, verteilen Sie es gleichmäßig und inkubieren Sie, bis sich eine durchgehende Bakterienschicht bildet.

Befeuchten Sie einen sterilen Tupfer mit einem eisenarmen Minimum Medium (LIMM) und sammeln Sie die Bakterien.

Hängen Sie sie in einem Plastikbehälter mit LIMM auf, um eine Eisenkontamination zu vermeiden.

Fügen Sie ein Dispergiermittel hinzu, um ein Verklumpen zu verhindern, und inkubieren Sie ohne Schütteln.

Unter eisenlimitierenden Bedingungen aktivieren Bakterien Stressreaktionen und produzieren Siderophore im Zytoplasma.

Diese werden in extrazelluläre Vesikel verpackt und an die Umgebung abgegeben.

Siderophore fangen Eisen ein und helfen Bakterien zu überleben.

Dieses System unterstreicht die Anpassung und das Überleben von Mykobakterien unter eisenbeschränkten Bedingungen

Eine einzelne MTB-Kolonie wird in zwei Milliliter mykobakterielles Bouillonmedium geimpft, das mit ADN-Anreicherung ergänzt wird. Unter Rühren bei 37 Grad Celsius inkubieren. Bei sichtbarem Wachstum werden zwei Milliliter der Kultur entnommen und der OD 540 mit einem Spektralphotometer gemessen.

Stoppen Sie die Inkubation, wenn der OD 540 0,8 erreicht, was auf die späte logarithmische Phase hinweist. Verteilen Sie 200 Mikroliter der spätlogarithmischen Kultur auf die mykobakteriellen Agarplatten, die mit 0,2 Glycerin, 0,5 % Tween 80 und ADN ergänzt werden. Impfen Sie mindestens fünf Platten.

Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius. Und nach einer Woche ist das Bakterienwachstum als konfluente Schicht sichtbar. Befeuchten Sie dann ein steriles Wattestäbchen mit einem bügelarmen Minimalmedium.

Verwenden Sie diesen Tupfer, um Bakterien von den Agarplatten zu sammeln. Beimpfen Sie die Bakterien in 100 Millilitern eisenarmem Minimalmedium in einem Röhrchen. Sammeln Sie genügend Bakterien, um eine Suspension mit einem OD 540 von eins herzustellen.

Verdünnen Sie die Suspension 10 mal auf einen Liter mit eisenarmem Minimalmedium und verteilen Sie sie auf zwei sterile Plastikflaschen. Übertragen Sie als Nächstes zwei Milliliter der Kultur in ein Fünf-Milliliter-Kulturröhrchen. 10 Mikroliter 10 Vol.-% Tyloxapol zugeben.

Inkubieren Sie die Kulturen 14 Tage lang bei 37 Grad Celsius.