Isolierung von siderophorhaltigen extrazellulären Vesikeln aus Mycobacterium tuberculosis

Nehmen Sie eine Mycobacterium tuberculosis-Kultur , die in einem eisenlimitierenden Medium gezüchtet wurde, um die Sekretion von extrazellulären Vesikeln zu verbessern, die Siderophore, einen Eisenchelator, enthalten.

Zentrifuge, um die Bakterien zu pelletieren.

Sammeln Sie den Überstand und filtern Sie ihn, um restliche Bakterien zu entfernen.

Übertragen Sie das Filtrat in ein gerührtes Ultrafiltrationssystem und einen Filter, um überschüssiges Medium zu entfernen und die Elektrofahrzeuge zu konzentrieren.

Zentrifugieren Sie das Konzentrat, um zelluläre Trümmer zu pelletieren.

Übertragen Sie den Überstand in ein Ultrazentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie, um das EV-Pellet aufzufangen.

Entsorgen Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Pellet in einem Puffer und mischen Sie es mit einem konzentrierten Dichtegradientenmedium, um die untere Schicht zu bilden.

Überlagern Sie es mit abnehmenden Konzentrationen des Gradientenmediums, um einen diskontinuierlichen Dichtegradienten zu erzeugen.

Oben Puffer hinzufügen und zentrifugieren. Die Elektrofahrzeuge wandern in die Schicht, die ihrer Auftriebsdichte entspricht.

Sammeln Sie jede Fraktion in einem separaten Röhrchen.

Die gereinigte Fraktion mit siderophorhaltigen EVs ist bereit für nachgelagerte Studien.

Die Kultur wird in fünf konische 225-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt und sieben Minuten lang bei 20 Grad Celsius bei 2.850 g zentrifugiert. Sammeln Sie den Kulturüberstand mit einer 50-Milliliter-Pipette und filtern Sie ihn, sterilisieren Sie ihn durch einen 0,22-Mikron-Filter.

Um MEVs zu isolieren, überführen Sie das Kulturfiltrat in ein Rührzellen-Ultrafiltrationssystem, das bei vier Grad Celsius platziert ist, und filtrieren Sie das Konzentrat bei einem Druck von weniger als 50 PSI durch eine 100-Kilodalton-Cutoff-Membran. Zentrifugieren Sie dann das konzentrierte Kulturfiltrat bei 15.000 g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius und sammeln Sie den Überstand in Polycarbonat-Ultrazentrifugationsröhrchen. Zentrifugieren Sie den Überstand bei 100.000 g für zwei Stunden bei vier Grad Celsius.

Danach entfernen Sie den Überstand und resuspendieren die membranösen Pellets in insgesamt einem Milliliter sterilem PBS durch schonendes Pipettieren. Mischen Sie 0,5 Milliliter der Pelletsuspension mit 1,5 Millilitern 60%iger Iodixanollösung am Boden eines dünnwandigen Ultrazentrifugenröhrchens aus Polypropylen. Überlagern Sie diese MEV-Iodixanol-45%-Suspension mit einem Milliliter 40 %, 35 %, 30 %, 25 % und 20 % igen Iodixanollösungen und einem Milliliter PBS obendrauf.

Zentrifugieren Sie 18 Stunden lang bei vier Grad Celsius bei 100.000 g Celsius. Verwenden Sie als Nächstes eine Ein-Milliliter-Hamilton-Spritze, um die Ein-Milliliter-Dichtegradientenfraktionen von oben zu sammeln. Jede gesammelte Fraktion auf 20 Milliliter mit PBS verdünnen und zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius bei 100.000 g zentrifugieren.

Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie ihn in 0,5 Millilitern PBS.