Isolierung bakterieller extrazellulärer Vesikel mittels Größenausschlusschromatographie

Nehmen Sie eine Größenausschlusschromatographie oder eine SEC-Säule, die mit porösen Harzkügelchen definierter Größe gefüllt ist. Er enthält oben ein Probenreservoir.

Fügen Sie phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder PBS hinzu, um die Säulenkügelchen auszugleichen, und verwerfen Sie den Durchfluss.

Laden Sie ein konzentriertes Bakterienkulturfiltrat, das extrazelluläre Vesikel oder EVs, sekretierte Proteine und Kontaminanten enthält.

EVs sind lipidbasierte Nanovesikel, die bioaktive Moleküle tragen und von Bakterien sezerniert werden.

Sobald das Filtrat in die Kügelchen eindringt, füge PBS hinzu, um es durch das Harzbett zu treiben.

Das ursprüngliche Eluat mit großen nicht-vesikulären Verunreinigungen ist zu verwerfen.

Platzieren Sie ein Auffangröhrchen unter dem Auslass und fügen Sie nacheinander PBS hinzu.

Großformatige EVs umgehen die kleineren Harzporen, bewegen sich durch die Zwischenräume zwischen den Kügelchen und eluieren zuerst.

Kleinere Proteine und Verunreinigungen dringen in die Poren ein, nehmen längere Wege und eluieren später.

Sammeln Sie die früh eluierenden Fraktionen, die EVs enthalten, und bewahren Sie sie für die Analyse auf.

Für die Isolierung der EVs führen Sie eine Größenausschlusschromatographie (SEC) durch, bei der eine kleine Säule mit einem Bettvolumen von 10 Millilitern für weniger als 100 Milliliter Ausgangsmaterial und eine größere Säule mit einem Bettvolumen von 47 Millilitern für mehr als 100 Milliliter Ausgangsmaterial verwendet wird. Bringen Sie die SEC-Säule und das PBS mehrere Stunden vor dem Experiment auf Raumtemperatur und stabilisieren Sie die Säule anschließend mit einem Standard-Laborstativ und -halter in vertikaler Position. Bevor Sie es an die SEC-Säule anschließen, hydratisieren Sie das Probenreservoir, indem Sie fünf Milliliter PBS durch die Fritte in einen Abfallbehälter fließen lassen.

Schrauben Sie dann den Einlassdeckel der Säule ab, um zwei Milliliter PBS in das Probenreservoir zu geben, und verbinden Sie das Reservoir vorsichtig mit der Säule, während das PBS durch die Fritte heraustropft. Zur Äquilibrierung der Säule geben Sie 47 Milliliter PBS in das Probenreservoir und öffnen Sie anschließend den Boden der SEC-Säule. Lassen Sie dann den gesamten geladenen Probenpuffer durch die Säule fließen und verwerfen Sie den Durchfluss.

Nachdem Sie zwei Milliliter der Probe in das Probenreservoir geladen haben, lassen Sie die Probe vollständig in die Säule gelangen und sammeln Sie den Durchfluss. Geben Sie sofort PBS mit einem Volumen von 14,25 Millilitern abzüglich des Probenvolumens in das Probenreservoir, damit die Lösung durch die Säule fließen kann, während die Menge, die dem Hohlraumvolumen der Säule entspricht, verworfen wird. Positionieren Sie als Nächstes ein Mikroröhrchen mit zwei Millilitern niedriger Bindung direkt unter der SEC-Säule, um den ersten Durchfluss oder die erste Fraktion zu sammeln, nachdem Sie zwei Milliliter PBS durch die Säule laufen ließen.

Geben Sie weiterhin zwei Milliliter PBS in das Probenreservoir, um jede weitere Fraktion zu sammeln. Lagern Sie die gesammelten Fraktionen bei vier Grad Celsius für die kurzfristige Lagerung oder minus 80 Grad Celsius für die langfristige Lagerung.