Fluoreszenzbildgebung von Biomaterial-assoziierten bakteriellen Infektionen in Zebrafischembryonen
JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiologie
0 Ansichten • 2:39 Min. • September 26th, 2025
Beginnen Sie mit anästhesierten Zebrafischembryonen, die mit fluoreszenzmarkierten pathogenen Bakterien injiziert werden, entweder allein oder gemischt mit Biomaterial-Mikrosphären, um eine Biomaterial-assoziierte Infektion in vivo zu modellieren.
Stellen Sie eine Petrischale mit Basalmedium mit Betäubungsmittel auf den Tisch eines Stereofluoreszenzmikroskops, das mit entsprechenden Filtern ausgestattet ist.
Geben Sie Methylcelluloselösung in die Schale, um ein viskoses Medium zu erzeugen, das die Embryonen für die Bildgebung immobilisiert.
Übertragen Sie einzelne Embryonen in die Methylcellulose und richten Sie sie horizontal aus, so dass die Injektionsstelle sichtbar ist.
Fokussieren Sie sich mit dem Hellfeldfilter auf die Injektionsstelle, um den infizierten Bereich zu erreichen.
Stellen Sie die Z-Stapel-Bildgebungsparameter ein und erfassen Sie Fluoreszenzbilder in verschiedenen Tiefen, um die Infektionsdynamik in drei Dimensionen zu erfassen.
Analysieren Sie mit Hilfe von Software die im Laufe der Zeit aufgenommenen Bilder, um die Fluoreszenzintensität zu quantifizieren und die Bakterienverteilung zu überwachen.
Dieses Protokoll ermöglicht einen direkten Vergleich des Infektionsverlaufs bei lebenden Embryonen mit und ohne Biomaterial-Exposition.
Stellen Sie eine 100-Millimeter-Petrischale, die E3-Medium enthält, das mit 0,02 % Tricain ergänzt ist, auf einen Stereofluoreszenzmikroskoptisch und geben Sie 500 Mikroliter 2 % Methylcellulose in die Petrischale. Um den Infektionsverlauf durch Fluoreszenzmikroskopie zu überwachen, rüsten Sie die entsprechenden Hellfeld- und Fluoreszenzfilter aus und richten Sie die anästhesierten infizierten Embryonen horizontal an einem Punkt aus Methylcellulose in einer Petrischale aus.
Verwenden Sie den Hellfeldfilter, um das beschädigte injizierte Gewebe bei einer 160-fachen Vergrößerung scharf zu stellen. Stellen Sie die Z-Stapeltiefe auf 10 Mikrometer und die Schrittweite auf fünf Mikrometer ein, um die Aufnahme von drei aufeinanderfolgenden Bildern zu ermöglichen. Bilden Sie dann die einzelnen Embryonen unter identischen optimierten Einstellungen bei einer 160-fachen Vergrößerung ab.
Verwenden Sie das ObjectJ-Plugin in ImageJ, um die Bilder zu analysieren.
Übersicht
Diese Studie stellt eine Methode zur Visualisierung der Infektionsdynamik in anesthetisierten Zebrafischembryonen mithilfe fluoreszenzmarkierter pathogener Bakterien vor. Das Protokoll ermöglicht einen direkten Vergleich des Infektionsverlaufs in lebenden Embryonen mit und ohne Exposition gegenüber Biomaterialien.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Infektionsbiologie
- Bildgebende Verfahren
Hintergrund
- Zebrafischembryonen sind ein wertvolles Modell, um Infektionen zu untersuchen.
- Die fluoreszenzmarkierte Färbung erleichtert die Visualisierung bakterieller Dynamiken.
- Biomaterial-Mikrokugeln können den Verlauf von Infektionen beeinflussen.
- Mittels Live-Bildgebung lassen sich Echtzeiteinblicke in den Fortschritt der Infektion gewinnen.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines Protokolls zur Bildgebung von Infektionen in Zebrafischembryonen.
- Beurteilung des Einflusses von Biomaterialien auf bakterielle Infektionen.
- Quantifizierung der Fluoreszenzintensität zur Überwachung der Infektionsdynamik.
Verwendete Methoden
- Injektion fluoreszierender Bakterien in Zebrafischembryonen.
- Verwendung von Methylcellulose zur Immobilisierung der Embryonen für die Bildgebung.
- Fluoreszenzmikroskopie zur Aufnahme der Infektionsdynamik.
- Bildanalyse mit dem ObjectJ-Plugin in ImageJ.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Visualisierung von Infektionsstellen in lebenden Embryonen.
- Quantifizierung der bakteriellen Verteilung über die Zeit.
- Vergleich des Infektionsverlaufs mit und ohne Biomaterialien.
- Einrichtung eines reproduzierbaren Bildgebungsprotokolls.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll ermöglicht eine detaillierte Untersuchung der Infektionsdynamik.
- Die gewonnenen Erkenntnisse können Strategien zur Bekämpfung biomaterialassoziiierter Infektionen unterstützen.
- Diese Methode kann für andere Krankheitserreger und Bedingungen angepasst werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die quantitative Fluoreszenz-Bildgebung in Zebrafischembryonen ermöglicht die direkte Visualisierung und Messung der mit Biomaterialien assoziierten Dynamik bakterieller Infektionen in vivo. Dieser Ansatz unterstützt die Validierung von Zielstrukturen in einem frühen Stadium sowie die mechanistische Risikominimierung für Forschungs- und Entwicklungsportfolios im Bereich Antiinfektiva und Biomaterialien. Die Methode liefert handlungsrelevante Daten zur Priorisierung von Kandidatenmaterialien und therapeutischen Maßnahmen basierend auf dem zeitlichen Verlauf der Infektion und den Wechselwirkungen zwischen Wirt und Pathogen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen unter Biomaterialien-Exposition in vivo.
- Unterstützt die mechanistische Risikominderung durch die quantitative Erfassung des Infektionsverlaufs in Echtzeit.
- Erleichtert die funktionelle Validierung von antiinfektiösen Zielstrukturen in einem lebenden Wirbeltiersystem.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bietet einen standardisierten, reproduzierbaren Bildgebungsprotokoll zur Quantifizierung von Infektionen.
- Erzeugt quantitative Fluoreszenzausgaben, die für den vergleichenden Screening von Biomaterialien oder Verbindungen geeignet sind.
- Ermöglicht die Assay-Entwicklung zur Bewertung der antiinfektiösen Wirksamkeit in einem physiologisch relevanten Kontext.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die Anpassung an translationsrelevante Infektionsmodelle zur Bewertung von Biomaterialien im Kontext von Erkrankungen.
- Ermöglicht einen nahtlosen Übergang von bildgebenden Verfahren in der Entdeckungsphase bis hin zu präklinischen Infektionsstudien.
- Unterstützt die risikoadjustierte Weiterentwicklung von Biomaterialkandidaten basierend auf In-vivo-Infektionsdaten.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses Bildgebungsprotokoll integriert sich in die Entwicklungs- bis präklinische Bandbreite für die Forschung und Entwicklung von Antiinfektiva und Biomaterialien und verbindet frühe mechanistische Studien mit nachgeschalteten Wirksamkeitstests.
- Entdeckungsbiologie: Quantifiziert Infektionslast und räumliche Verteilung, um Wirt-Pathogen-Biomaterial-Mechanismen aufzuklären.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Messwerte zum Vergleich von Kandidaten und zur Standardisierung von Assays.
- Analytik: Verwendet Fluoreszenzintensitätsmessungen und Bildanalyse für robuste Datenausgaben.
- Translationale Forschung: Stellt in-vivo-Infektionsdaten bereit, die die Auswahl präklinischer Modelle und die Abstimmung von Biomarkern unterstützen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet einen wiederverwendbaren Workflow für Bildgebung und Analyse, der an unterschiedliche Infektions- und Biomaterialstudien angepasst werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bezüglich Infektionsausgängen und Zielstrukturenvalidierung.
- Operationaler Wert: Standardisiert Bildgebung und Analyse für Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit.
- Strategischer Wert: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen für Biomaterialien und antiinfektiöse Wirkstoffkandidaten auf Grundlage quantitativer In-vivo-Daten.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von F&E-Ressourcen anhand translationsrelevanter Infektionsdaten.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit Zebrafischen, in Mikroinjektion und in Fluoreszenzmikroskopie.
- Benötigt Zugang zu stereoskopischen Fluoreszenzmikroskopen mit Z-Stapel-Funktion und geeigneten Filtern.
- Erfordert standardisierte Bildaufnahmeparameter und Analyseabläufe für die Vergleichbarkeit zwischen Studien.
- Anpassbar an verschiedene Bakterienstämme und Biomaterialtypen bei Optimierung des Protokolls.
- Abhängig von leistungsfähigen Bildanalysewerkzeugen wie ObjectJ in ImageJ für quantitative Ergebnisse.
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Zuletzt aktualisiert: 29 August 2026