In vivo Analyse implantatassoziierter bakterieller Infektionen anhand von Zebrafischembryonen

Beginnen Sie mit einer Schale, die eine Agarosekammer enthält, die mit Rillen geformt ist.

Jede Rille hält anästhesierte Zebrafischembryonen, die in ein Embryomedium getaucht sind, das mit einem Anästhetikum ergänzt wurde.

Führen Sie unter einem Lichtmikroskop eine Mikroinjektionsnadel in das Muskelgewebe ein.

Injizieren Sie eine Suspension, die S. aureus und Polystyrol-Mikrosphären enthält, um eine implantatassoziierte Infektion zu modellieren.

Die injizierten Embryonen werden in einzelne Vertiefungen einer mit einem frischen Medium gefüllten Multi-Well-Platte überführt und inkubiert.

Mikrosphären bieten eine physikalische Oberfläche, die die bakterielle Besiedlung unterstützt und Infektionen begünstigt.

Um eine implantatassoziierte bakterielle Infektion zu beurteilen, geben Sie jeden Embryo in ein separates Röhrchen und waschen Sie es mit einem Puffer. Fügen Sie Puffer und Keramikperlen hinzu.

Homogenisieren, um die Embryonen zu lysieren und den inneren Inhalt, einschließlich Bakterien, freizusetzen.

Die verdünnten Homogenate plattieren und dann inkubieren, um die Koloniebildung zu ermöglichen.

Embryonen, die mit der Mikrosphären-Bakteriensuspension injiziert wurden, weisen eine höhere Koloniezahl auf als solche, denen nur die Bakteriensuspension injiziert wurde. Dies deutet darauf hin, dass die Mikrosphären die Infektionsanfälligkeit erhöhen.

Nachdem Sie fünf Minuten gewartet haben, bis die Embryonen betäubt sind, richten Sie die Embryonen in den Rillen in einer einzigen Ausrichtung für ihre Injektion aus. Stellen Sie den Mikroinjektor auf die entsprechenden Injektionseinstellungen ein und führen Sie die Nadel in einem Winkel von 45 bis 60 Grad unter einem Stereomikroskop in das Muskelgewebe des ersten Embryos ein.

Bewegen Sie die Nadel vorsichtig hin und her, um die Position im Gewebe nach Bedarf anzupassen, und verwenden Sie das Mikroinjektor-Fußpedal, um die geladene Suspension zu injizieren. Bei der Injektion einer Bakterien-Mikrosphären-Suspension in das Gewebe von Zebrafischembryonen sollte die Nadel vorsichtig, aber mit ruhiger Hand eingeführt werden. Nach erfolgreichem Einsetzen sollte vor dem Einspritzen ein Platz für die Materialien geschaffen werden.

Und halten Sie die Embryonen im E3-Medium ohne Tricain in einzelnen Vertiefungen von 48-Well-Platten mit täglichem Mediumwechsel. Um das Fortschreiten der Infektion durch die Quantifizierung der koloniebildenden Einheit zu überwachen, werden kurz nach der Injektion fünf bis sechs lebensfähige infizierte Embryonen nach dem Zufallsprinzip in einzelne Zwei-Milliliter-Mikroröhrchen überführt und die Embryonen vorsichtig mit sterilem PBS gewaschen. Nachdem Sie die Waschmittel verworfen haben, geben Sie 100 Mikroliter steriles PBS in jedes Röhrchen, gefolgt von zwei bis drei sterilen Zirkonoxidkügelchen mit einem Durchmesser von zwei Millimetern.

Zerkleinern Sie dann die Embryonen in einem Homogenisator bei 3.500 U/min für 30 Sekunden und kultivieren Sie das Homogenat wie gezeigt.