JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiologie
0 Ansichten • 2:30 Min. • September 26th, 2025
Nehmen Sie eine metabolisch aktive Kultur von Mycobacterium marinum. Dies gewährleistet eine hohe bakterielle Lebensfähigkeit und einen optimalen physiologischen Zustand.
Zentrifugieren Sie die Kultur, um die Bakterien zu pelletieren.
Der überschüssige Überstand wird verworfen und das Pellet in einem frischen Medium, das ein Dispergiermittel enthält, wieder suspendiert.
Übertragen Sie die Suspension in Mikrozentrifugenröhrchen und beschallen Sie sie unter kontrollierten Bedingungen.
Die Beschallung zerstört bakterielle Aggregate und zerstreut die Zellen, was zu einer lebensfähigen Einzelzellsuspension führt.
Sammeln Sie die beschallte Suspension in einer Spritze und leiten Sie sie durch einen Membranfilter, um verbleibende Klumpen zu entfernen, um eine gleichmäßige Einzelzellpopulation zu gewährleisten.
Messen Sie mit einem Spektralphotometer die optische Dichte der Bakteriensuspension.
Verdünnen Sie die Suspension mit frischen Kryoprotektiva-haltigen Medien, um die gewünschte Bakterienkonzentration zu erreichen und gleichzeitig die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten.
Aliquotieren Sie die endgültige einzellige Suspension und lagern Sie sie bei extrem niedrigen Temperaturen. Das Kryoprotektivum trägt dazu bei, die Lebensfähigkeit der Bakterien während der Langzeitlagerung zu erhalten.
Nach der Inokulation laut Manuskript zentrifugieren Sie die Kultur bei 3000 mal G für 10 Minuten, um das Mycobacterium marinum als Pellet zu sammeln. Entsorgen Sie alle bis auf 300 Mikroliter des Überstands und suspendieren Sie das Pellet wieder.
Fügen Sie drei Milliliter 7H9-Medium mit 10 % Glycerin hinzu, um das Pellet weiter zu resuspendieren, und beschallen Sie dann die Suspension in einem Wasserbad bei 100 Watt, mit 15 Sekunden an und 15 Sekunden aus, für insgesamt zwei Minuten, um ein einzelnes Zellhomogenat zu erhalten. Übertragen Sie die Bakteriensuspension in eine 10-Milliliter-Spritze und passieren Sie einen Fünf-Mikron-Filter, um alle Bakterienklumpen zu entfernen. Messen Sie mit einem Spektralphotometer die optische Dichte der Suspension und verdünnen Sie sie mit 7H9-Medien mit 10 % Glycerin auf OD 600 bei eins.
Die Suspension in 10 Mikroliter Aliquots aufteilen und zur weiteren Verwendung bei minus 80 Grad Celsius im Gefrierschrank lagern.