Quantifizierung bakterieller infektionsinduzierter Amyloide mittels Thioflatin-T-Fluoreszenz

Nehmen Sie eine Küvette, die eine Arbeitslösung von Thioflavin T enthält, einem Amyloid-spezifischen Fluoreszenzfarbstoff, der in phosphatgepufferter Kochsalzlösung gelöst ist.

Legen Sie die Küvette in ein Spektrofluorometer und zeichnen Sie das Fluoreszenzsignal in der Basislinie auf.

Halten Sie den Scan an und entfernen Sie die Küvette.

Fügen Sie den filtersterilisierten Kulturüberstand hinzu, der aus pulmonalen Endothelzellen gewonnen wurde, die mit virulenten Pseudomonas-Bakterien infiziert waren.

Der Überstand enthält Amyloid-Aggregate, bei denen es sich um fehlgefaltete, beta-faltblattreiche Proteine handelt.

Mischen Sie den Inhalt vorsichtig durch Inversion, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten.

Laden Sie die Küvette erneut in das Spektrofluorometer und setzen Sie den Scanvorgang fort, um ein zeitbasiertes Fluoreszenzsignal zu erhalten.

Thioflavin T bindet spezifisch an beta-faltblattreiche Amyloide, was zu einer erhöhten Fluoreszenz führt.

Führen Sie einen Fluoreszenzscan mit den gleichen Einstellungen durch.

Ein Anstieg der Fluoreszenz im Vergleich zum Ausgangswert weist auf das Vorhandensein und die relative Häufigkeit von infektionsinduzierten Amyloiden im Kulturüberstand hin.

Um die Amyloide im Überstand zu quantifizieren, fügen Sie 20 Mikroliter frisch zubereiteter und filtrierter 50-facher Thioflatin-T-Stammlösung zu einem Milliliter PBS in einer Ein-Milliliter-Spektrophotometer-Küvette hinzu und laden Sie die verdünnte Probe auf ein Spektrofluorometer.

Messen Sie die Fluoreszenzemission in der Basislinie mit einer 425-Nanometer-Anregung. Abtastung der Fluoreszenzemission von 450 bis 575 Nanometern in zwei Nanometerschritten. Stellen Sie dann das Gerät so ein, dass es einen Zeitrafferscan mit einer 425-Nanometer-Anregung und einer 482-Nanometer-Emission mit Datenerfassung alle 0,2 Sekunden für 60 Sekunden durchführt.

Pausieren Sie den Scan nach 20 Sekunden und geben Sie 10 Mikroliter filtersterilisierten Überstand in die Küvette. Nach dem Mischen durch Inversion wird die Küvette wieder auf das Spektrofluorometer geladen und der zeitbasierte Scan für die letzten 40 Sekunden fortgesetzt. Führen Sie nach Abschluss des Zeitraffers einen abschließenden Scan des Fluoreszenzemissionsspektrums mit den ursprünglichen Scaneinstellungen durch.