Generierung von Double-Crossover-Rekombinanten von Pseudomonas aeruginosa für die gezielte Gendeletion

Beginnen Sie mit einer Kultur von rekombinantem Pseudomonas aeruginosa in einem Antibiotika-Auswahlmedium.

Diese Bakterien beherbergen ein nicht-replikatives Plasmid, das in das Genom integriert ist, in der Nähe des bakteriellen Zielgens, das zur Deletion bestimmt ist.

Die Integration erfolgte über homologe Sequenzen, die zwischen dem Plasmid und dem Genom geteilt wurden, was zu einer einzigen Crossover-Rekombination führte.

Das Plasmid kodiert für ein Antibiotikaresistenz-Gen und das sacB-Gen , das eine Saccharose-Sensitivität verleiht.

Streichen Sie die Bakterien auf ein Medium, das Saccharose enthält, aber das Antibiotikum fehlt, und inkubieren Sie.

Ohne Antibiotikadruck kommt es zu einer zweiten Rekombination oder einem doppelten Crossover zwischen homologen Regionen, bei der das Plasmid und das Zielgen herausgeschnitten werden.

Bei der bakteriellen Vermehrung wird das exzidierte Plasmid nicht weitergegeben, wodurch die Bakterien saccharosetolerant werden.

Pflastern Sie die Bakterien auf ein nicht-selektives Medium und ein Medium, das Saccharose oder das Antibiotikum enthält, und inkubieren Sie.

Das Wachstum auf den nicht-selektiven und Saccharose-Medien, nicht aber auf dem antibiotischen Medium, bestätigt eine erfolgreiche Doppelkreuzung.

Beginnen Sie mit dem Anbau von rekombinanten Single-Crossover-Kolonien in Pseudomonas Isolation Bouth oder PIB. 10 Mikroliter jeder Kultur inokulieren und auf vorgewärmte PIA-Platten streichen, ergänzt mit 10 % Saccharose. Dann inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius.

Nehmen Sie am nächsten Tag die Platten aus dem Inkubator und untersuchen Sie sie auf Wachstum. Die Saccharose-resistente Kolonie sollte aus Double-Crossover-Rekombinanten bestehen. Verwenden Sie sterile Zahnstocher, um mindestens 20 Kolonien auf vorgewärmte Platten aus PIA, PIA mit 10 % Saccharose und PIA mit Carbenicillin zu flicken.

Inkubieren Sie die Platten über Nacht und untersuchen Sie sie am nächsten Tag auf Wachstum. Echte Double-Crossover-Rekombinanten sind Carbenicillin-sensitiv und Saccharose-resistent.