Generierung von Double-Crossover-Rekombinanten von Pseudomonas aeruginosa für die gezielte Gendeletion

JoVE Encyclopedia of Experiments

Mikrobiologie

0 Ansichten • 2:27 Min. • September 26th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beginnen Sie mit einer Kultur von rekombinantem Pseudomonas aeruginosa in einem Antibiotika-Auswahlmedium.

Diese Bakterien beherbergen ein nicht-replikatives Plasmid, das in das Genom integriert ist, in der Nähe des bakteriellen Zielgens, das zur Deletion bestimmt ist.

Die Integration erfolgte über homologe Sequenzen, die zwischen dem Plasmid und dem Genom geteilt wurden, was zu einer einzigen Crossover-Rekombination führte.

Das Plasmid kodiert für ein Antibiotikaresistenz-Gen und das sacB-Gen , das eine Saccharose-Sensitivität verleiht.

Streichen Sie die Bakterien auf ein Medium, das Saccharose enthält, aber das Antibiotikum fehlt, und inkubieren Sie.

Ohne Antibiotikadruck kommt es zu einer zweiten Rekombination oder einem doppelten Crossover zwischen homologen Regionen, bei der das Plasmid und das Zielgen herausgeschnitten werden.

Bei der bakteriellen Vermehrung wird das exzidierte Plasmid nicht weitergegeben, wodurch die Bakterien saccharosetolerant werden.

Pflastern Sie die Bakterien auf ein nicht-selektives Medium und ein Medium, das Saccharose oder das Antibiotikum enthält, und inkubieren Sie.

Das Wachstum auf den nicht-selektiven und Saccharose-Medien, nicht aber auf dem antibiotischen Medium, bestätigt eine erfolgreiche Doppelkreuzung.

Beginnen Sie mit dem Anbau von rekombinanten Single-Crossover-Kolonien in Pseudomonas Isolation Bouth oder PIB. 10 Mikroliter jeder Kultur inokulieren und auf vorgewärmte PIA-Platten streichen, ergänzt mit 10 % Saccharose. Dann inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius.

Nehmen Sie am nächsten Tag die Platten aus dem Inkubator und untersuchen Sie sie auf Wachstum. Die Saccharose-resistente Kolonie sollte aus Double-Crossover-Rekombinanten bestehen. Verwenden Sie sterile Zahnstocher, um mindestens 20 Kolonien auf vorgewärmte Platten aus PIA, PIA mit 10 % Saccharose und PIA mit Carbenicillin zu flicken.

Inkubieren Sie die Platten über Nacht und untersuchen Sie sie am nächsten Tag auf Wachstum. Echte Double-Crossover-Rekombinanten sind Carbenicillin-sensitiv und Saccharose-resistent.

07:18

Gen gezielt Random Mutagenesis Heterochromatin destabilisieren Proteasom Mutanten in Spalthefe auswählen

Ähnliche Videos

0 Aufrufe

08:13

Herstellung von Gen-Deletionen in Escherichia coli durch P1 Transduktion mit verbrauchsteuerpflichtigen Antibiotikaresistenz Kassetten

Ähnliche Videos

0 Aufrufe

12:29

Erzeugung von Nullmutanten zur Aufklärung der Rolle bakterieller Glykosyltransferasen in der bakteriellen Motilität

Ähnliche Videos

0 Aufrufe

14:06

Mapping Bakterielle Functional Netzwerke und Pathways in Escherichia Coli Verwendung von Synthetic Genetic Arrays

Ähnliche Videos

0 Aufrufe

04:14

Generierung von Antibiotika-markierten Mutanten in Cyanobakterien durch homologe Rekombination

Ähnliche Videos

0 Aufrufe

03:36

Generating Gene Deletions in E. coli via Phage-Mediated Transfer of an Excisable Antibiotic Cassette

Ähnliche Videos

0 Aufrufe

09:52

Genetische Manipulation in Δku80 Die Stämme für Funktionelle Genomanalyse Toxoplasma gondii

Ähnliche Videos

0 Aufrufe

08:57

Identifizierung neuer Gene, die mit Alginat-Produktion verbunden in Pseudomonas aeruginosa Mit Mini- Himar1 Mariner Transposon-vermittelte Mutagenese

Ähnliche Videos

0 Aufrufe

09:40

Generierung von Genomic Löschungen in Säugerzelllinien über CRISPR / Cas9

Ähnliche Videos

0 Aufrufe

10:10

Genetic Engineering eines Unconventional Hefe für Erneuerbare Biokraftstoff- und Biochemie Produktion

Ähnliche Videos

0 Aufrufe

Zuletzt aktualisiert: 15 August 2026