Fluoreszenz-Zeitraffer-Bildgebung des Lebenszyklus von Streptomyces venezuelae

Nehmen Sie eine mikrofluidische Platte mit einer Vertiefung mit Sporen von Streptomyces venezuelae, einem hyphenbildenden Bakterium.

Andere ausgewiesene Vertiefungen enthalten entweder nährstoffreiches oder verbrauchtes Medium.

Die Sporen stammen von einem Stamm, der fluoreszierende DivIVA- und FtsZ-Proteine exprimiert, die an Hyphenspitzen bzw. Querwänden lokalisiert sind.

Tragen Sie Immersionsöl auf die Objektivlinse eines inversen Mikroskops und auf das Bildgebungsfenster der Platte auf.

Montieren Sie die Platte auf dem Mikroskoptisch und beginnen Sie mit der Zeitrafferaufnahme.

Laden Sie die Sporen in die Kulturkammer der Platte.

Führen Sie dann das nährstoffreiche Medium ein, um die Sporenkeimung einzuleiten.

Wenn die Hyphen wachsen, sammelt sich DivIVA an den Hyphenspitzen an, während FtsZ an den Querwänden vereinzelte Ringe bildet.

Wechseln Sie als Nächstes zum verbrauchten Medium. Der Mangel an Nährstoffen in diesem Medium begünstigt die Sporulation.

In den sprießenden Hyphen verschwinden die DivIVA-Herde, und FtsZ reorganisiert sich zu einer regelmäßigen Leiter von Teilungsringen, die Sporulationssepten bilden.

Im Laufe der Zeit bestätigt das Verschwinden der FtsZ-Fluoreszenz in denselben Hyphen den Abschluss der Sporulation.

Heizen Sie die Klimakammer vorher auf 30 Grad Celsius vor.

Schalten Sie dann das Mikroskop und die Mikroskopsteuerungssoftware ein. Setzen Sie ein Ölimmersionsobjektiv mit hoher numerischer Apertur ein und vergewissern Sie sich, dass die entsprechenden Filter und Diagrammspiegel, die für die Aufnahme von differentiellen Interferenzkontrastbildern eingestellt sind, zusammen mit den Bildern der gelben fluoreszierenden und der rot fluoreszierenden Proteinfusion vorhanden sind. Geben Sie einen Tropfen Immersionsöl in das Objektiv und auf den Boden des Bildfensters auf der Mikrofluidikplatte.

Montieren Sie das versiegelte mikrofluidische Gerät vorsichtig auf dem Tisch des inversen Mikroskops und befestigen Sie es. Verwenden Sie die eingebetteten Positionsmarker, um das Bildgebungsfenster der mikrofluidischen Kulturkammer in den Fokus zu bringen. Fokussieren Sie sich auf den linken Teil der ersten Strömungskammer mit der Bezeichnung A und bewegen Sie dann den Tisch auf die Fallgröße fünf, was der Fallhöhe von 0,7 Mikrometern entspricht.

Stellen Sie in der mikrofluidischen Software das System so ein, dass Zellen aus der Einlassöffnung acht bei vier psi für 15 Sekunden gewogen werden. Überprüfen Sie nach Ablauf des Prozesses die Zelldichte in der Kulturkammer, indem Sie den Tisch über das Bildgebungsfenster bewegen. Wenn keine Sporen eingeschlossen wurden, wiederholen Sie den Schritt der Zellbeladung oder erhöhen Sie alternativ den Ladedruck und/oder die Zeit, bis die gewünschte Zelldichte von einer bis 10 Sporen pro Bildgebungsfenster erreicht ist.

Achten Sie darauf, dass die Kulturkammer nicht überlastet wird. Starten Sie anschließend das zuvor vorbereitete Strömungsprogramm in der Steuerungssoftware und lassen Sie die mikrofluidische Platte eine Stunde lang im Mikroskoptisch erhitzen, bevor Sie mit der Bildaufnahme beginnen. Richten Sie in der Mikroskopsteuerungssoftware eine mehrdimensionale Aufnahme ein, um mehrere Bilder an mehreren Tischpositionen im Laufe der Zeit aufzunehmen, indem Sie zunächst ein Verzeichnis für das automatische Speichern der Bilddateien angeben.

Gehen Sie als Nächstes zu den Beleuchtungseinstellungen und geben Sie die vorgegebenen optimalen Beleuchtungseinstellungen für jedes spezifische Konstrukt ein. Richten Sie dann eine Zeitreihe ein, um Bilder 24 Stunden lang alle 40 Minuten aufzunehmen. Um die Tischpositionen zu bestimmen und den Autofokus einzustellen, scannen Sie die Kulturkammer und speichern Sie die Tischpositionen für jede gewünschte Bildposition.

Stellen Sie sicher, dass die einstufigen Positionen weit genug voneinander entfernt sind, um Photobleiche und Phototoxizität zu minimieren. Sobald die Z-Koordinaten der ausgewählten Tischpositionen überprüft wurden, aktivieren Sie den Hardware-Autofokus. Starten Sie dann das Zeitraffer-Experiment in der Mikroskopsteuerungssoftware.

Stoppen Sie die Bildaufnahme nach 24 bis 30 Stunden oder wenn sich die Hyphen in der interessierenden Region zu Sporen differenziert haben. Stoppen Sie dann das Strömungsprogramm in der Software und zerlegen Sie das mikrofluidische Gerät. Bereiten Sie die gebrauchte mikrofluidische Platte für die kurzfristige Lagerung vor, indem Sie das restliche Medium aus den Einlassvertiefungen, der Abfallvertiefung und der Zellladevertiefung entfernen.

Füllen Sie dann die gebrauchten Vertiefungen der Bahn A und die Vertiefungen der ungenutzten Bahnen mit sterilem PBS auf. Zum Schluss versiegelst du die Platte mit Birnenfolie, damit sie nicht austrocknet. Und lagern Sie die Platte bei vier Grad Celsius.