Bildgebung und Quantifizierung von Schwarmvermeidungsreaktionen auf Antibiotikastress bei Pseudomonas aeruginosa

Nehmen Sie eine Schwarm-Agarplatte, die die Schwarmmotilität unterstützt – eine koordinierte bakterielle Bewegung über eine halbfeste Oberfläche, die rankenartige Muster bildet.

Beimpfen Sie die Mitte der Platte mit einer Pseudomonas aeruginosa-Kultur und platzieren Sie eine Mischung aus derselben Kultur mit einem Antibiotikum an gleichmäßig verteilten Satellitenpositionen.

Decken Sie die Platte mit einem schwarz lackierten Deckel ab, um Lichtreflexionen zu minimieren.

Legen Sie die Platte auf einen Flachbettscanner in einem Inkubator, der bei optimaler Luftfeuchtigkeit gehalten wird.

Während der Inkubation beginnt sich die zentrale Population zu vermehren und zu schwärmen.

Wenn sich der Schwarm den mit Antibiotika behandelten Kolonien nähert, erkennt er Stresssignale, die von den Bakterien abgesondert werden, und leitet um, um diese Regionen zu meiden.

Der Scanner, gesteuert von einer automatisierten Software, nimmt in regelmäßigen Abständen hochauflösende Bilder auf.

Stellen Sie diese Bilder zu einem Video zusammen, um das Fortschreiten und die Vermeidung von Schwärmen im Laufe der Zeit zu visualisieren.

Quantifizieren Sie die Schwarmvermeidung, indem Sie den Abstand zwischen jeder Satellitenkolonie und dem Rand des zentralen Schwarms in einem Bild im Spätstadium messen.

Nachdem Sie die Platten in den Scanner eingelegt haben, öffnen Sie die Datei- und Speichereinstellungen, um den Speicherpfad für die Bilder festzulegen, und klicken Sie in 30-Minuten-Intervallen auf Scannen und OK. Um die Bildaufnahme zu automatisieren, verwenden Sie die Skriptsoftware.

Wählen Sie sowohl Leerlauf-Scan als auch Einzel-Scan aus, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Leerlauf-Scan und klicken Sie dann mit der linken Maustaste auf Aktiviert. Importieren Sie am Ende der Inkubation alle gescannten Bilder in ImageJ. Im Fenster mit den Sequenzoptionen gibt die Anzahl der Bilder die Anzahl der ausgewählten Bilder an.

Halten Sie das Startbild bei eins, um mit dem ersten Bild im Ordner zu beginnen, und skalieren Sie die Bilder bei 100 %, um die Originalgröße der Bilder beizubehalten. Klicken Sie auf In RGB konvertieren, um die Bilder in Farbe zu halten. Lassen Sie die Option Virtuellen Stapel verwenden deaktiviert und klicken Sie auf OK, um die Bilder zu laden.

Klicken Sie auf Datei, Speichern unter und AVI, um die Bilder in einer AVI-Datei zusammenzuführen. Passen Sie die Komprimierung auf JPEG und die Bildrate auf fünf Bilder pro Sekunde an. Speichern Sie dann den AVI-Zeitraffer im entsprechenden Speicherordner.