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Beginnen Sie mit einem geschmolzenen Agarmedium, das das Bakterienwachstum unterstützt.
Fügen Sie einen Eisenchelator hinzu, um das freie Eisen zu erschöpfen, und ergänzen Sie das Medium mit Kalzium.
Gießen Sie das Medium in eine Schüssel, lassen Sie es fest werden und trocknen Sie es dann, um die Restfeuchtigkeit zu entfernen.
Nehmen Sie eine Brühe von Vibrio parahaemolyticus, einem gegeißelten Bakterium.
In flüssigen Medien liegen die Bakterien in einer kurzen, stäbchenförmigen Schwimmerform mit einem Flagellum vor.
Platzieren Sie die Kultur auf der Platte und lassen Sie sie trocknen, um den bakteriellen Kontakt mit der Oberfläche zu fördern.
Verschließen Sie die Schale und inkubieren Sie, damit sich flüchtige Stoffwechselnebenprodukte der Bakterien ansammeln können.
Oberflächenkontakt, Eisenlimitierung, Kalziumverfügbarkeit und akkumulierte Nebenprodukte induzieren die Genexpression, die die Differenzierung in längliche Schwarmzellen mit lateralen Flagellen auslöst und die Bewegung über feste Oberflächen ermöglicht.
Die Schwarmzellen dehnen sich nach außen aus und bilden Schwarmfackeln, die aus vollständig differenzierten Zellen bestehen, was auf eine erfolgreiche Differenzierung hinweist.
Um die Agarlösung für die Herstellung von Schwarmplatten herzustellen, suspendieren Sie vier Gramm Herzinfusion oder H.I.-Agarpulver und 100 Milliliter doppelt destilliertes Wasser.
Kochen Sie die H.I.-Agar-Lösung vorsichtig in der Mikrowelle und schütteln Sie die Flasche von Zeit zu Zeit, bis sich das Pulver aufgelöst hat. Autoklavieren Sie die Agarlösung 20 Minuten lang bei 121 Grad Celsius, kühlen Sie die Agarlösung unter ständigem Rühren auf 60 bis 65 Grad Celsius ab. Der nächste Schritt ist der Umgang mit 2,2'-Bipyridyl, das hochgiftig ist, so dass Handschuhe und Schutzbrille getragen werden müssen.
2,2'-Bipyridyl wird bis zu einer Endkonzentration von 50 μmolar zugegeben. Fügen Sie Calciumchlorid bis zu einer Endkonzentration von vier Millimolar hinzu. Eine kleine Menge V . parahaemolyticus-Zellen vom Rand einer einzelnen Kolonie in 5 Milliliter LB-Brühe impfen.
Inkubieren Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius in einem Shaker-Inkubator, bis sie eine optische Dichte von 0,8 Nanometern bei 600 Nanometern erreicht. Dies dauert in der Regel etwa zwei bis drei Stunden. Während die Zellkultur wächst, pipettieren Sie 30 bis 35 Milliliter der endgültigen H.I.-Agarlösung in eine runde 150-Millimeter-Petrischale und lassen Sie den Agar erstarren.
Trocknen Sie die Agarplatte unmittelbar vor dem Spotten der Zellkultur aufrecht bei geöffnetem Deckel für mindestens 10 Minuten oder bis alle Flüssigkeitsrückstände verschwunden sind, aber nicht länger. Platzieren Sie einen Mikroliter Zellkultur in der Mitte der H.I.-Agar-Schwarmplatte und lassen Sie den Fleck trocknen. Verschließen Sie die Platte mit durchsichtigem Plastikband und achten Sie darauf, dass sich keine Luftblasen bilden und Falten am Klebeband entstehen.
Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 24 Grad Celsius. Dies führt zur Bildung einer V. parahaemolyticus-Schwarmkolonie mit Schwarmfackeln, die sich vom Zentrum der Kolonie aus erstrecken, wie in diesem Zeitraffer-Videoclip zu sehen ist.