JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiologie
0 Ansichten • 2:37 Min. • September 26th, 2025
Beginnen Sie mit zwei Bakterienstämmen, einem Referenz- und einem Konkurrenten, die jeweils einen eindeutigen Fluoreszenzmarker zur Stammidentifizierung exprimieren.
Mischen Sie die Stämme zu gleichen Anteilen und geben Sie die Mischung auf eine Agarplatte.
Inkubiere die Platte, damit die Stämme wachsen und interagieren können.
Der Mitbewerber verdrängt den Referenzstamm entweder durch kontaktabhängige oder berührungsunabhängige Mechanismen.
Im kontaktabhängigen Wettbewerb nutzt der Wettbewerber spezialisierte Sekretionssysteme, um Toxine direkt in den Referenzstamm zu bringen.
Bei der kontaktlosen Konkurrenz setzt der Wettkämpfer Giftstoffe frei, die in das umgebende Medium diffundieren und in den Referenzstamm gelangen.
Diese Toxine stören wesentliche Prozesse im Referenzstamm, einschließlich der Zellwandsynthese, der DNA-Replikation und der Proteinsynthese, was zu Wachstumsstillstand, Zelltod und verminderter Fluoreszenzexpression führt.
Untersuchen Sie die Platte nach der Inkubation unter einem Fluoreszenzmikroskop.
Eine reduzierte Fluoreszenz im Referenzstamm im Vergleich zur helleren Fluoreszenz des Mitbewerbers deutet auf kompetitive Wechselwirkungen hin.
Um den Referenzstamm und den Stamm der Mitbewerber in einem Verhältnis von eins zu eins zu mischen, geben Sie 100 Mikroliter jedes Stammes, normiert auf OD 1,0, in ein markiertes 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und wirbeln Sie es ein bis zwei Sekunden lang. Mischen Sie als Kontrolle den Referenzstamm mit einer differentiell getaggten Version von sich selbst und dem Vortex.
Es ist wichtig, das richtige Startverhältnis zu erreichen, da es das Ergebnis des Experiments erheblich verändern kann. Um den Erfolg zu gewährleisten, kann dieser Schritt eine Optimierung für eine bestimmte Bakterienart erfordern. Nach Wiederholung dieses Schritts für jedes biologische Replikat sollte es vier biologische Replikate mit differentiell markierten Referenzstämmen als Kontrollen und vier biologische Replikate mit differentiell markierten Referenz- und Konkurrenzstämmen geben.
Um Kulturspots herzustellen, die nach der Inkubation für die Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden, geben Sie 10 Mikroliter jeder Kontroll- und Versuchsmischung auf eine Petriplatte, die LBS-Agar enthält. Nachdem die Flecken auf der Bank vollständig getrocknet sind, inkubieren Sie die Platten 24 Stunden lang bei 24 Grad Celsius.