Bakterienwachstum auf einem mikrofluidischen Chip zur Untersuchung der Resistenz von Antibiotika

Nehmen Sie mikrofluidische Chips mit Wachstums- und Medikamentenkammern, die durch ein mikromechanisches Ventil getrennt sind.

Wildtyp- und TMP-resistente mutierte E. coli-Stämme, die in Medien suspendiert sind, werden unter Druck in die Wachstumskammern geladen, in denen Trimethoprim (TMP) das getestete Antibiotikum ist.

Beladen Sie anschließend die Medikamentenkammern mit Medien, die eine geringe Konzentration an TMP enthalten, um zellulären Stress in Bakterien zu induzieren.

Betätigen Sie das mikromechanische Ventil, um die TMP-Diffusion in die Wachstumskammern zu ermöglichen und so den Eintritt von TMP in die Bakterien zu ermöglichen.

Legen Sie die Chips in den Inkubator, der auf dem inversen Mikroskoptisch montiert ist, und starten Sie die Zeitrafferaufnahme.

In Wildtyp-E. coli bindet TMP an das Enzym Dihydrofolatreduktase, wodurch die Dihydrofolatbindung verhindert und eine stressinduzierte Filamentation und eine verminderte bakterielle Vermehrung verursacht wird.

Die veränderte DHFR-Struktur des mutierten Stammes verhindert jedoch die TMP-Bindung, was eine normale Vermehrung ermöglicht.

Beobachten Sie die Zeitrafferbilder.

Wildtyp-E. coli zeigt unter TMP-Behandlung eine Filamentierung und eine verminderte Vermehrung, während der mutierte Stamm eine normale Morphologie und Vermehrung aufweist, was auf eine Antibiotikaresistenz hinweist.

Nachdem Sie die täglich gefrorene Probe fünf Minuten lang bei Raumtemperatur aufgetaut haben, beimpfen Sie ein neues Reagenzglas mit frischem M9-Medium.

Legen Sie die Probe über Nacht bei 37 Grad Celsius in einen Schüttelinkubator. Am nächsten Tag verdünnen Sie die mikrobielle Probe mit M9-Medium um das Zehnfache und laden Sie sie in das mikrofluidische Gerät, indem Sie den mikrobiellen Probenbehälter mit fünf PSI unter Druck setzen. Laden Sie dann das TMP-haltige Medium in den Chip, indem Sie den M9 mit TMP-Behälter mit fünf PSI unter Druck setzen.

Führen Sie das Mischen zwischen der Mikrobe und dem Medikament durch, indem Sie das mikromechanische Ventil zwischen den beiden Kammern auf dem mikrofluidischen Chip 15 Minuten lang betätigen. Platzieren Sie abschließend den mikrofluidischen Chip in den Mikroskop-Inkubator, der auf dem inversen Mikroskop montiert ist. Mit einer CCD-Kamera können Sie acht Stunden lang stündlich Zellbilder in der Wachstumskammer aufnehmen.

Berechnen Sie die Daten der Zellzahl gemäß dem Textprotokoll.