JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiologie
0 Ansichten • 3:28 Min. • September 26th, 2025
Nehmen Sie einen Tank mit einem sterilen Wachstumsmedium mit saurem pH-Wert.
Setzen Sie ein Maschensieb mit Pflanzensetzlingen in den Tank um.
Versiegeln Sie mit einem Deckel und porösem Klebeband, um die Sterilität zu erhalten und gleichzeitig einen Gasaustausch zu ermöglichen.
Inkubieren Sie durch Schütteln, um das Medium zu belüften.
Untersuchen Sie das Medium, um zu überprüfen, ob es keine Trübungen gibt, die darauf hinweisen, dass keine bakterielle Kontamination vorliegt.
Platzieren Sie eine Probe auf einer Kulturplatte und inkubieren Sie sie, um das Fehlen von Bakterienwachstum zu beobachten und die Abwesenheit von kontaminierenden Bakterien zu bestätigen.
Mit Agrobacterium, einem Pflanzenpathogen, impfen und inkubieren.
Aus der Pflanzenwurzel gewonnene Signalmoleküle und der saure pH-Wert aktivieren ein bakterielles membrangebundenes Sensorprotein.
Die Aktivierung induziert die Genexpression und produziert Proteine für die bakterielle Anheftung an Wurzeloberflächen.
Nach der Bindung liefert Agrobacterium ein DNA-Fragment , die sogenannte Transfer-DNA (T-DNA), über ein Sekretsystem in die Pflanzenzellen.
Bei der Integration in das Pflanzengenom synthetisiert die T-DNA Signalmoleküle, die die bakterielle Besiedlung verstärken.
Gießen Sie in einer sterilisierten Strömungshaube 18 Milliliter autoklaviertes flüssiges MS-Medium in sterile zylindrische Glastanks mit sterilen Deckeln.
Als nächstes überträgst Du jedes Maschenquadrat mit 10 bis 14 Tage alten Sämlingen vorsichtig mit einer sterilen Pinzette aus der Petrischale mit halbfestem Medium in einen hydroponischen zylindrischen Tank. Bei den hier gezeigten Sämlingen handelt es sich um Luzerne. Verschließen Sie die Deckel mit porösem chirurgischem Klebeband auf den Tanks.
Kultivieren Sie die Sämlinge dann bei 22 bis 24 Grad Celsius mit einer 16-stündigen Fotoperiode und Schütteln bei 50 U/min. Untersuchen Sie vor der Inokulation den Tank mit den Setzlingen sorgfältig auf mögliche Verunreinigungen. Das Medium in den unverschmutzten Tanks sollte klar und transparent sein.
Wenn die Tanks durch Verunreinigungen trüb sind, entsorgen Sie sie und nummerieren Sie die restlichen Tanks. Nehmen Sie eine Probe von 20 Mikrolitern hydroponischem Medium aus jedem nummerierten Tank und verteilen Sie es auf eine Petrischale mit Luria-Brühe oder LB-Agar. Inkubieren Sie das Gericht 28 Stunden lang bei 28 Grad Celsius.
Impfen Sie sofort jeden nummerierten Hydrokulturtank mit 50 Mikrolitern der Agrobacterium tumefacians-Suspension in jeden nummerierten Hydrokulturtank. Kultivieren Sie die Sämlinge und das Bakterium A. tumefacians bei 22 bis 24 Grad Celsius mit einer 16-stündigen Fotoperiode und Schütteln bei 50 U/min. Untersuchen Sie die gefleckte LB-Platte nach 12 und 28 Stunden Inkubation, um die Sterilität des hydroponischen Wachstumsmediums zu überprüfen.
Im Falle einer Kontamination ist der entsprechende nummerierte Tank, der mit Bakterien beimpft wurde, nicht für weitere nachgelagerte Assays zu verwenden.