JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Mikrobiologie
0 Aufrufe • 2:35 Min. • September 26th, 2025
Beginnen Sie mit einem kammerförmigen Objektträger, der mit einer Trägermembran aus Phospholipiden, einschließlich biotinylierter Phospholipide, beschichtet ist.
Inkubieren Sie mit Neutravidin, das an Biotin auf der Doppelschicht bindet. Waschen, um das überschüssige Neutravidin zu entfernen.
Führen Sie ein Nährmedium ein, das Riesenvesikel oder GVs enthält. Jedes GV ist ein kugelförmiges, mikrometergroßes Lipid-Doppelschicht-Vesikel, das eine einzelne Bakterienzelle einkapselt und als Modell für die Untersuchung des Verhaltens einzelner Zellen in einer begrenzten Umgebung dient.
Neutravidin bindet an biotinylierte GV-Lipide und bindet die Vesikel an die Trägermembran für eine stabile, langfristige Beobachtung unter statischen Bedingungen.
Versiegeln Sie die Kammer, um die Hydratation aufrechtzuerhalten und die Kontamination zu minimieren.
Legen Sie den Objektträger auf einen Mikroskoptisch, der mit einer Heizplattform ausgestattet ist, um physiologische Bedingungen zu simulieren und unter einem Mikroskop zu beobachten.
Nährstoffe aus dem Medium diffundieren in das GV, um das Bakterienwachstum im Laufe der Zeit zu unterstützen.
Dieser Aufbau ermöglicht die Echtzeit-Visualisierung des einzelligen Bakterienwachstums in begrenzten Vesikel-Mikroumgebungen.
Um Riesenvesikel auf der Träger-Doppelschichtmembran zu immobilisieren, führen Sie 10 Mikroliter Neutravidin in äußerer wässriger Riesenvesikellösung für eine 15-minütige Inkubation bei Raumtemperatur in das Loch ein.
Waschen Sie das Loch am Ende der Inkubation zweimal vorsichtig mit 20 Mikrolitern LB-Medium, ergänzt mit 200 Millimolar Glukose, und geben Sie das gesamte Volumen der Riesenvesikellösung in das Loch in der Kammer. Verschließen Sie dann das Loch mit einem 18 mal 18 Millimeter großen Deckglas. Um das Bakterienwachstum in den riesigen Vesikeln zu überwachen, wählen Sie das 40X-Objektiv an einem inversen Mikroskop aus und platzieren Sie die Kammer auf dem Heiztischsystem des Mikroskops.
Anschließend werden die in Bakterienzellen enthaltenen Riesenvesikel in der Kammer unter statischen Bedingungen sechs Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubiert und alle 30 Minuten Bilder des bakteriellen Zellwachstums mit der wissenschaftlichen komplementären Metalloxid-Halbleiterkamera aufgenommen und aufgezeichnet.