Untersuchung der bakteriellen Reaktion auf Ethylen mit einer Ethylen-freisetzenden Verbindung

Beginnen Sie mit einer Multi-Well-Platte mit Wachstumsmedien, die mit zelluloseproduzierenden Bakterien vorgeimpft sind.

In der behandelten Vertiefung wird das Medium mit 2-Chlorethylphosphonsäure (CEPA) ergänzt.

Verschließen Sie die Platte, um einen Gasaustausch zu verhindern, und inkubieren Sie.

Während der Inkubation hydrolysiert CEPA und setzt Ethylen, ein gasförmiges Molekül, frei.

Ethylen aktiviert die bakterielle Cellulosesynthase, die zytosolische UDP-Glukose zur Synthese von Cellulose verwendet.

Im Laufe der Zeit extrudieren die Bakterien Zellulose durch ihre Membran.

Dies fördert die bakterielle Selbstorganisation an der Grenzfläche zwischen Luft und Flüssigkeit und bildet einen schwimmenden Biofilm auf Zellulosebasis (Pellikel).

Nach der Inkubation die Pellikel auf eine frische Multi-Well-Platte geben. Fügen Sie eine alkalische Lösung hinzu und inkubieren Sie bei einer höheren Temperatur, um die Zellen zu lysieren.

Entfernen Sie die alkalische Lösung. Wiederholtes Waschen unter Rühren, um Zellreste zu entfernen, während die Zellulose erhalten bleibt.

Die Pellikel trocknen und wiegen. Ein höheres Trockengewicht in den CEPA-behandelten Proben im Vergleich zur Kontrolle deutet auf eine erhöhte bakterielle Celluloseproduktion als Reaktion auf Ethylen hin.

Der Pellicle-Assay ist ein Standard-Analysewerkzeug für die Herstellung von bakterieller Cellulose. Der pH-Wert und die morphologische Analyse sind im Textprotokoll detailliert beschrieben. Zur Vorbereitung werden Zellen aus Starterkulturen in dreifacher Ausfertigung entnommen und mit einer Petroff-Hauser-Zählkammer quantifiziert.

Bereiten Sie dann vier mittelgroße Mastermixe mit unterschiedlichen CEPA-Konzentrationen vor. Für jeden Mastermix aliquotieren Sie 60 Milliliter pH 7 SH-Medium und fügen Sie 120 Mikroliter entweder 0, 5, 50 oder 500 Millimolar CEPA-Stammlösung hinzu, um CEPA-Endkonzentrationen von 0, 0,01, 0,1 oder 1,0 Millimolar zu erhalten. Mischen Sie diese Medien, indem Sie die Kolben schwenken.

Für jedes der Triplikate wird ein Satz Medien benötigt, und ein vierter Satz wird benötigt, um als sterile Kontrolle zu fungieren. Teilen Sie also jede 60-Milliliter-Mediumzubereitung in vier 14-Milliliter-Aliquots auf. Dann kühlen Sie die 14-Milliliter-Aliquote vor, bevor Sie sie mit den jeweiligen Starterkulturen auf eine Endkonzentration von 100.000 Zellen pro Milliliter beimpfen.

Bewahren Sie alle geimpften Röhrchen auf Eis auf, um die Zelluloseproduktion zu verhindern. Verwenden Sie die restlichen 14 Milliliter Aliquots für sterile Kontrollvertiefungen. Laden Sie nun von jedem 14-Milliliter-Mastermix zwei Milliliter-Aliquots in sechs Vertiefungen einer sterilen 24-Well-Platte, so dass insgesamt vier geladene Platten pro analysierter Starterkultur erhalten werden.

Verschließen Sie die Platten vorsichtig mit Paraffinfolie und inkubieren Sie sie sieben Tage lang statisch bei 30 Grad Celsius. Um ein Pellikel von der Platte zu nehmen, drücke eine Seite des Pellikels zusammen, um die gegenüberliegende Kante anzuheben und mit einer Pinzette aufzunehmen.

Übertragen Sie als Nächstes die Pellicles einzeln in die Vertiefungen einer Platte mit sechs Vertiefungen. Behandeln Sie sie 20 Minuten lang mit 12 Millilitern 0,1 normalem Natriumhydroxid bei 80 Grad Celsius, um die Zellen zu lysieren. Entfernen Sie dann das Natriumhydroxid und neutralisieren Sie die behandelten Pellikel, indem Sie sie 24 Stunden lang gründlich mit 12 Millilitern Reinstwasser waschen und in einer Platte mit sechs Vertiefungen umrühren.

Wechseln Sie während dieser Inkubation das Wasser alle sechs Stunden. Wenn die Inkubation beendet ist, sollten die Pellikel weiß sein. Legen Sie dann die Pellikel auf Silikonmatten und trocknen Sie sie 48 Stunden lang bei 50 Grad Celsius, um sie für die Trockengewichtsmessung vorzubereiten.