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Mikrobiologie
0 Aufrufe • 2:41 Min. • September 26th, 2025
Beginnen Sie mit einem Bakterienpellet. Die Bakterien enthalten ein Gen, das für ein Initiatorprotein kodiert, aber kein Antibiotikaresistenzgen.
Suspendieren Sie das Pellet in gekühltem Wasser, um den Zellabbau zu minimieren.
Nehmen Sie ein Plasmid, das ein Antibiotikaresistenzgen und ein Zielgen trägt. Dieses Plasmid wird als Selbstmordplasmid bezeichnet, da es sich ohne das Initiatorprotein nicht vermehren kann.
Geben Sie das Plasmid in die Bakteriensuspension.
Die Suspension in eine gekühlte Küvette geben.
Initiieren Sie die Elektroporation, indem Sie einen Hochspannungsimpuls anlegen, der die Bakterienmembran vorübergehend aufbricht und das Plasmid eindringen lässt.
Geben Sie Rückgewinnungsmedium hinzu und geben Sie die Mischung in ein Kulturröhrchen.
Durch Schütteln inkubieren.
Nehmen Sie eine Agarplatte mit dem Antibiotikum und plattieren Sie die Kultur.
Das bakterielle Initiatorprotein bindet an den Ursprung der Replikation, wodurch das Plasmid in die Lage versetzt wird, sich zu replizieren und ein Antibiotikaresistenzprotein zu exprimieren.
Dies ermöglicht es den Bakterien mit dem Plasmid, zu überleben und zu wachsen, was die Plasmidvermehrung erleichtert.
Pelletieren Sie die Bakterienkultur durch Zentrifugation bei 5.000 G und vier Grad Celsius für 15 Minuten. Suspendieren Sie das Pellet in gekühltem destilliertem Wasser und wiederholen Sie den Reinigungsvorgang noch zwei weitere Male.
Übertragen Sie die Bakteriensuspension in Mikrofuge-Röhrchen und wiederholen Sie die Zentrifugation bei 14.000 Mal G und vier Grad Celsius für fünf Minuten. Nachdem Sie das Pellet in kaltem Wasser resuspendiert haben, fügen Sie etwa 3,5 Mikroliter der Ligationsmischung hinzu und inkubieren Sie fünf Minuten lang auf Eis. Den Inhalt in eine gekühlte Elektroporationsküvette mit einem Abstand von zwei Millimetern geben.
Nach der Elektroporation das SOC-Medium hinzufügen und den Inhalt in ein Kulturröhrchen überführen. Eine Stunde lang bei 30 Grad Celsius inkubieren und bei 200 U/min schütteln. Plattieren Sie die transformierten Zellen auf LB-Agarplatten, die mit Chloramphenicol ergänzt sind.