Isolierung gramnegativer Bakterien mit genomischen Transposon-Insertionen

Beginnen Sie mit dem Auftauen einer gefrorenen Kultur der verpaarten gramnegativen Bakterienpopulation von Spender und Empfänger auf Eis.

Die Empfängerzellen tragen Transposons, kurze DNA-Abschnitte, die ein Resistenzgen gegen das Antibiotikum Kanamycin enthalten. Diese Transposons werden zufällig in das Wirtsgenom integriert.

Geben Sie die Kultur in eine nährstoffreiche Agarplatte, die Kanamycin, aber ohne spenderspezifische Nährstoffe enthält.

Fügen Sie sterile Kügelchen hinzu und drehen Sie die Platte vorsichtig, um die Kultur gleichmäßig zu verteilen.

Die Kügelchen entfernen und inkubieren. Empfängerbakterien verwerten Nährstoffe, aber nur solche mit integrierten Transposons widerstehen Kanamycin, was zur Koloniebildung führt.

Die Spender- und Empfängerbakterien ohne Transposons wachsen nicht.

Zählen Sie koloniebildende Einheiten, um die Anzahl der Empfängerbakterien mit eindeutigen Transposon-Insertionen zu schätzen.

Fügen Sie frische Medien hinzu und sammeln Sie die Bakterienpopulation.

Zentrifugieren Sie, um die Bakterien zu pelletieren, und entsorgen Sie den Überstand.

Resuspendieren Sie das Pellet in einem Medium mit Kryoprotektivum, um die Lebensfähigkeit der Bakterien zu erhalten