Isolierung gramnegativer Bakterien mit genomischen Transposon-Insertionen

Beginnen Sie mit dem Auftauen einer gefrorenen Kultur der verpaarten gramnegativen Bakterienpopulation von Spender und Empfänger auf Eis.

Die Empfängerzellen tragen Transposons, kurze DNA-Abschnitte, die ein Resistenzgen gegen das Antibiotikum Kanamycin enthalten. Diese Transposons werden zufällig in das Wirtsgenom integriert.

Geben Sie die Kultur in eine nährstoffreiche Agarplatte, die Kanamycin, aber ohne spenderspezifische Nährstoffe enthält.

Fügen Sie sterile Kügelchen hinzu und drehen Sie die Platte vorsichtig, um die Kultur gleichmäßig zu verteilen.

Die Kügelchen entfernen und inkubieren. Empfängerbakterien verwerten Nährstoffe, aber nur solche mit integrierten Transposons widerstehen Kanamycin, was zur Koloniebildung führt.

Die Spender- und Empfängerbakterien ohne Transposons wachsen nicht.

Zählen Sie koloniebildende Einheiten, um die Anzahl der Empfängerbakterien mit eindeutigen Transposon-Insertionen zu schätzen.

Fügen Sie frische Medien hinzu und sammeln Sie die Bakterienpopulation.

Zentrifugieren Sie, um die Bakterien zu pelletieren, und entsorgen Sie den Überstand.

Resuspendieren Sie das Pellet in einem Medium mit Kryoprotektivum, um die Lebensfähigkeit der Bakterien zu erhalten.

Tauen Sie ein Aliquot der gefrorenen Paarung auf Eis auf. Verteilen Sie dann mit sterilen Glaskügelchen 150 Mikroliter der Verdünnung auf jede 30 x 150 Millimeter große Luria-Bertani-Agarplatte, ergänzt mit Kanamycin.

Entsorgen Sie das gebrauchte Röhrchen mit überschüssigem Passgut und inkubieren Sie die Platten 14 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation werden die koloniebildenden Einheiten auf jeder Platte gezählt, um die Gesamtzahl der Mutanten in der Transposon-Bibliothek zu schätzen. Zählen Sie 20 % von mindestens drei Platten, um die Schätzung der Koloniezahl für die gesamte Plattengruppe zu bestimmen.

Nachdem Sie den geschätzten Koloniertrag berechnet haben, geben Sie drei bis fünf Milliliter LB auf jede Platte und kratzen Sie die Bakterien mit einem sterilen Schaberwerkzeug ab. Ziehen Sie die Bakteriensuspensionen von allen Platten in konische 50-Milliliter-Röhrchen und pelletieren Sie die Suspensionen, indem Sie sie sieben Minuten lang bei 5.000 Mal G zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in fünf Millilitern LB, ergänzt mit 30 % Glycerin.

Stellen Sie dann einen Milliliter Aliquote der Transposonbibliothek in Kryoröhrchen her und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius.