JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Mikrobiologie
0 Aufrufe • 3:13 Min. • September 26th, 2025
Nehmen Sie eine S. aureus-Kultur , die empfindlich auf das Antibiotikum Chloramphenicol reagiert.
Zentrifuge, um die Bakterien zu pelletieren und den Überstand zu entfernen.
Füllen Sie das Pellet in ein Röhrchen mit nährstoffbegrenzendem Medium und inkubieren Sie. Nährstoffstress erhöht die Kompetenz - die Fähigkeit des Bakteriums, fremde DNA zu internalisieren.
Erneut zentrifugieren und den Überstand entfernen. Resuspendieren Sie das Pellet in frischen nährstoffbegrenzenden Medien.
Fügen Sie als Nächstes DNA hinzu, die aus einem S. aureus-Stamm extrahiert wurde, der ein Chloramphenicol-resistentes Gen trägt. Ausbrüten.
Die DNA-Aufnahmemaschinerie verarbeitet die DNA zu einem einzigen Strang und transloziert sie in das Zytoplasma, wo sie sich in das bakterielle Chromosom integriert.
Zentrifugieren und den Überstand entfernen. Resuspendieren Sie das Pellet in nährstoffreichen Medien.
Die Suspension wird in geschmolzenen, nährstoffreichen Agar überführt, der Chloramphenicol enthält.
Die Mischung in eine Schüssel geben und inkubieren.
Das Wachstum von Chloramphenicol-resistenten Kolonien deutet auf eine erfolgreiche DNA-Aufnahme hin.
Kultivieren Sie die Empfängerzelle über Nacht in fünf Millilitern TSB bei 37 Grad Celsius unter Schütteln. Am nächsten Morgen werden 0,5 Milliliter der Nachtkultur in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen umgefüllt.
Fältitieren Sie die Zellen durch Zentrifugation. Suspendieren Sie dann die Zellen mit 10 Millilitern CS2-Medium in einem 50-Milliliter-Röhrchen. Als nächstes züchten Sie die Bakterien bei 37 Grad Celsius und schütteln bei 180 Umdrehungen pro Minute für acht Stunden bis zur späten exponentiellen Phase.
Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 10 Millilitern frischem CS2-Medium. Geben Sie 10 Mikrogramm gereinigtes Plasmid oder genomische DNA zur Zellsuspension.
Schütteln Sie die Kultur mit 180 Umdrehungen pro Minute. Anschließend werden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt. Resuspendieren Sie die Zellen in 10 Millilitern BHI-Medium.
Mischen Sie die Zellsuspension mit 90 Millilitern geschmolzenem BHI-Agar-Präparat mit 32 Milligramm pro Liter Chloramphenicol und fünf Mikrogramm pro Liter Tetracyclin im Kontrollexperiment. Gießen Sie die Mischung in die 90-Millimeter-Petrischalen und kühlen Sie sie schnell ab und lassen Sie den Agar fest. Replizieren Sie die Kolonien mit Zahnstochern auf Platten mit geeigneten Antibiotika, um ihre Resistenzeigenschaften zu bestätigen.