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Mikrobiologie
0 Aufrufe • 2:29 Min. • September 26th, 2025
Beginnen Sie mit einer Platte mit vorgezüchteten RNA-Interferenz- oder RNAi-exprimierenden Bakterien.
Diese Bakterien tragen Plasmide, die ein Antibiotikaresistenzgen und ein Zielgeninsert enthalten, das doppelsträngige RNA oder dsRNA produziert, um die spezifische Genexpression im Wirt zu hemmen.
Übertragen Sie die Kolonien mit einer sterilen Nadel in eine Deep-Well-Platte, die ein mit Antibiotika angereichertes Medium enthält.
Inkubieren Sie die Platte durch Schütteln für ein gleichmäßiges Bakterienwachstum, wobei die tiefen Vertiefungen für die Belüftung sorgen.
Das Antibiotikum eliminiert Bakterien, denen das Plasmid fehlt, und sorgt dafür, dass nur plasmidtragende Bakterien überleben.
Zentrifugieren Sie die Platte, um die Bakterien zu trennen, und entsorgen Sie den Überstand.
Suspendieren Sie die Bakterien in einer gepufferten Kochsalzlösung, um sie zu stabilisieren.
Geben Sie die resuspendierten Bakterien in eine Multi-Well-Platte mit nährstoffreichem Medium, das sowohl mit einem Antibiotikum als auch mit einem Induktor ergänzt ist.
Das Antibiotikum selektiert plasmidtragende Bakterien, während der Induktor die dsRNA-Expression auslöst.
Die mit RNAi-exprimierenden Bakterien besiedelte Platte ist bereit für weitere Assays.
Um mehrere RNAi-Bakterienstämme parallel in einer einzigen Vertiefung einer 24-Well-Deep-Well-Platte zu testen, inokulieren Sie eine einzelne Kolonie aus jedem Klon zuvor hergestellter RNAi-haltiger Bakterien in vier Milliliter mit Carbenicillin-supplementiertem LB. Legen Sie die Platten 16 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 950 U/min in einen für Multiwell-Platten optimierten Schüttelinkubator. Anschließend werden die Bakterien durch Zentrifugation bei 2.000 g für 5 Minuten gesammelt. Dekantieren Sie den Überstand, indem Sie die Platte umdrehen und kräftig schütteln.
Mit 100 Mikrolitern S Basal resuspendieren die RNAi-Bakterien. Pipettieren Sie die resuspendierten Bakterien in eine angemessene Anzahl von Vertiefungen einer mit IPTG und Carbenicillin ergänzten Multi-Well-NGM-Platte und lassen Sie die Platte trocknen.