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Mikrobiologie
0 Ansichten • 3:27 Min. • September 26th, 2025
Beginnen Sie mit einer E. coli-Kultur , die mit einem Antibiotikum vorbehandelt ist.
Dieses Antibiotikum blockiert die Zellteilung, was zur Bildung von länglichen filamentösen Zellen mit erhöhtem DNA-Gehalt führt.
Einen Teil der Kultur auf eine nährstoffreiche Agarplatte geben und inkubieren.
Filamentöse Zellen teilen sich trotz anhaltendem Wachstum nicht; Nur nicht-filamentöse Zellen bilden Kolonien, was zu niedrigen Koloniezahlen führt.
Verdünnen Sie die restliche Bakterienkultur und fügen Sie einen fluoreszierenden DNA-bindenden Farbstoff hinzu. Dann im Dunkeln inkubieren.
Der Farbstoff dringt in die Zellen ein und bindet an die DNA.
Wirbeln Sie die Probe und leiten Sie sie dann durch ein Durchflusszytometer.
Die Menge des gestreuten Lichts von jeder Zelle entspricht ihrer Größe.
In ähnlicher Weise zeigt die von farbstoffgebundenen Nukleinsäuren emittierte Fluoreszenz den bakteriellen DNA-Gehalt an.
Mit Antibiotika behandelte Zellen zeigen eine erhöhte Streuung und Fluoreszenz, was das filamentöse Wachstum und die fortgesetzte DNA-Replikation ohne Teilung widerspiegelt.
Dies zeigt Veränderungen in der bakteriellen Physiologie, die durch zellteilungshemmende Antibiotika verursacht werden.
Bereiten Sie zehnfache serielle Verdünnungen bis zu 10 bis zum minus Siebtel der 200 Mikroliter Kulturprobe in frischem Medium vor.
Mischen Sie zwischen jeder Verdünnung durch sehr sanftes Vortexen oder durch Umdrehen des Röhrchens. 100 Mikroliter der entsprechenden Verdünnung auf nicht selektierte LB-Agaroseplatten auffüllen und über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren. Zählen Sie am nächsten Tag die Anzahl der Kolonien, um die Konzentration lebensfähiger Zellen in jeder Kulturprobe zu bestimmen.
Die KBE pro Milliliter wird als Funktion der Zeit für die unbehandelten und behandelten Zellkulturen aufgetragen. Messen Sie den OD 600 der Kultur mit einem Spektralphotometer. Verdünnen Sie die Kulturprobe mit frischem Medium bei vier Grad Celsius, um eine Probe mit OD 600 bei 0,06 zu erhalten, was etwa 15.000 Zellen pro Mikroliter entspricht.
Für die DNA-Färbung wird die verdünnte Bakterienprobe mit einer Lösung von 10 Mikrogramm pro Milliliter DNA-Fluoreszenzfarbstoff im Volumenverhältnis von eins zu eins gemischt und 15 Minuten lang im Dunkeln inkubiert. Vor der Injektion der Probe wird die Probe durch sehr sanftes Vortexen oder durch Umdrehen des Röhrchens gemischt. Geben Sie die Probe mit einer Durchflussrate von ca. 120.000 Zellen pro Minute in das Durchflusszytometer.
Erfassen Sie vorwärts gestreutes und seitlich gestreutes Licht sowie DNA-Fluoreszenzfarbstoff/Fluoreszenzsignal mit den entsprechenden Einstellungen.