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Eine Bakterienspore bleibt aufgrund einer Peptidoglykan-Cortex-Schicht, einem Polymer aus Zuckern und Aminosäuren, inaktiv.
Während der Keimung wird die Rinde abgebaut, um Zucker an das umgebende Medium abzugeben.
Um den Abbau der Rinde zu erkennen, beginnen Sie mit dem Medium, das die freigesetzten Zucker enthält, die zu definierten Zeitpunkten während der Sporenkeimung gesammelt wurden.
Verwenden Sie steigende Konzentrationen von Zuckerstandards als Referenz.
Die Standards und die Proben wurden zuvor einer Behandlung unterzogen, um den Zucker in eine reaktive Form umzuwandeln.
Inkubieren Sie mit dem Ehrlich-Reagenz, einem kolorimetrischen Nachweisreagenz, das mit Zuckern reagiert und einen violetten Komplex bildet.
Übertragen Sie die Mischungen auf eine Multiwell-Platte und messen Sie die Absorption der farbigen Komplexe mit einem Mikroplatten-Reader.
Die Absorption entspricht der violetten Farbintensität, die direkt proportional zur Zuckerkonzentration ist.
Ein Anstieg der Absorption über die Zeitpunktproben hinweg deutet auf einen fortschreitenden Kortexabbau hin.
Generieren Sie ein Diagramm aus den Standardkonzentrationen und quantifizieren Sie die Probenkonzentrationen.
Während die Proben auf Eis liegen, bereiten Sie das Farbreagenz vor. Lösen Sie 0,320 Gramm DMAB in 1,9 Millilitern Eisessig. Beachten Sie, dass dieses Reagenz zeit-, temperatur- und lichtempfindlich ist und nicht im Voraus hergestellt werden sollte.
Nachdem sich das DMAB vollständig aufgelöst hat, fügen Sie 100 Mikroliter 10 normale Salzsäure hinzu und wirbeln Sie die Probe ein. Dann fünf Milliliter Eisessig zugeben und erneut vortexen. Für die kolorimetrische Reaktion werden 100 Mikroliter jeder gekühlten Rinde oder Kontrollprobe in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt.
Geben Sie 700 Mikroliter der frisch zubereiteten Farblösung zu jeder Probe. Übertragen Sie die Proben sofort in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad und inkubieren Sie die Proben genau 20 Minuten lang. Nach der Inkubation werden 200 Mikroliter jeder Probe auf eine durchsichtige 96-Well-Platte umgefüllt.
Die Proben sollten zunächst gelb gefärbt sein, wechseln aber zu violett, wenn reduzierender Zucker vorhanden ist, der auf das Vorhandensein von Kortex hinweist. Hier zeigen viele der Proben keine sichtbare violette Farbe. Die 250-, 500- und 5.000-Nanomol-Proben unterscheiden sich jedoch visuell von der negativen Null-Nanomol-Kontrolle.
Bestimmen Sie mit einem Plattenleser die Absorption bei 585 Nanometern. Bei der Messung in einem Außendurchmesser von 585 Nanometern passt das aus den Standardproben erzeugte Signal am besten zu einer linearen Regression.