Rekombinante Proteinproduktion und -rückgewinnung aus bakteriellen Vesikeln

Beginnen Sie mit einer Kultur einer Bakterienspezies, die für rekombinante Proteine kodiert, die mit dem Vesicle Nucleating Peptide (VNp) markiert sind, einem kurzen Peptid, das die Vesikelbildung fördert.

Fügen Sie der Kultur einen Induktor hinzu und inkubieren Sie. Der Induktor löst die Proteinexpression aus.

VNp bettet sich in die innere Membran ein und fördert die Membrankrümmung, indem es die VNp-markierten Proteine in knospende Vesikel einkapselt.

Übertragen Sie das vesikelreiche Medium in ein Röhrchen. Zentrifugieren Sie es, um den vesikelreichen Überstand zu trennen.

Filtrieren Sie anschließend den Überstand, um Restverunreinigungen zu entfernen.

Führen Sie dann das Filtrat durch einen weiteren Membranfilter, um Vesikel auf der Membranoberfläche einzufangen.

Legen Sie die Membran in eine Schale und fügen Sie phosphatgepufferte Kochsalzlösung hinzu.

Löse die Vesikel vorsichtig ab und übertrage die Suspension in ein sauberes Röhrchen.

Beschallen Sie die Suspension, um die Vesikelmembranen aufzubrechen und die Proteine freizusetzen.

Zentrifugieren Sie das Lysat, um Membranfragmente zu trennen.

Der resultierende Überstand enthält gereinigte rekombinante Proteine, die für die Analyse bereit sind.

Induzieren Sie die rekombinante Proteinexpression aus dem T7-Promotor durch Zugabe von IPTG bis zu einer Endkonzentration von bis zu 20 Mikrogramm pro Milliliter oder 84 Mikromolar. Nachdem Sie ausreichend Zeit für die Induktion gelassen haben, pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 3000 g und 4 Grad Celsius für 20 Minuten. Der Überstand wird durch einen sterilen und reinigungsmittelfreien 0,45-Mikron-PES-Filter geleitet, um das vesikelhaltige Medium für die Langzeitlagerung zu sterilisieren.

Um die Vesikel auf ein kleineres Volumen zu konzentrieren, führen Sie das sterile Vesikel, das das Medium enthält, durch einen sterilen und reinigungsmittelfreien 0,1-Mikron-MCE-Filter. Waschen Sie dann die Membran vorsichtig mit 0,5 bis 1 Milliliter steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und verwenden Sie einen Zellschaber oder Kunststoffspreizer, um die Vesikel vorsichtig von der Membran zu entfernen. Übertragen Sie das Vesikelkonzentrat mit einer Pipette in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen.

Gereinigte Vesikel können bei 4 Grad Celsius gelagert werden. Das Protein, das Vesikel enthält, wird in den sterilen Medien unter Verwendung eines geeigneten Zeitplans beschallt, um die vesikulären Lipidmembranen zu stören und Protein freizusetzen. Zentrifugieren Sie die beschallte Suspension bei 39.000 g und 4 Grad Celsius für 20 Minuten, um die vesikulären Trümmer zu entfernen.