JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiologie
0 Ansichten • 1:28 Min. • October 30th, 2025
Nehmen Sie eine Kultur von Corynebacterium glutamicum, transformiert mit einem Plasmid, das ein fluoreszierendes Reportergen stromabwärts der Ribonukleinsäure-Antiterminator- oder RAT-Sequenz trägt, in einer Multiwell-Platte.
Während der Transkription bildet die RAT-RNA eine Stammschleifenstruktur, die die RNA-Polymerase blockiert und die Expression des Reportergens stoppt.
Das Plasmid exprimiert auch konstitutiv LicV, ein Fusionsprotein, das das RAT-RNA-bindende Protein LicT und die blaulichtempfindliche VVD-Domäne umfasst.
In der Dunkelheit bleibt LicV monomer und bindet nicht an die RAT-RNA-Stammschleife, die die Transkription des Reportergens blockiert.
Beleuchten Sie die Kultur mit blauem Licht, um eine Konformationsänderung in der VVD-Domäne zu induzieren, die die LicV-Dimerisierung auslöst.
Das dimerisierte LicV bindet an die RAT-RNA, entfaltet die Stammschleifenstruktur und ermöglicht es der RNA-Polymerase, das Reportergen zu transkribieren und das fluoreszierende Reporterprotein zu produzieren.
Beobachten Sie die Kultur unter einem Fluoreszenzmikroskop.
Eine starke Reporterfluoreszenz nach Blaulichtbeleuchtung und eine minimale Fluoreszenz in der Dunkelheit bestätigen eine erfolgreiche optogenetische Kontrolle.