JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiologie
0 Ansichten • 2:15 Min. • October 30th, 2025
Nehmen Sie einen Objektträger mit ruhenden Bakteriensporen und fluoreszierenden Mikrosphären als Referenz.
Die Sporen tragen rot und grün fluoreszierende Reporter für Keimproteine, wobei die innere Membran mit einem lipophilen Farbstoff gefärbt ist.
Montieren Sie den Objektträger auf ein Mikroskop mit strukturierter Beleuchtung oder SIM, das mit einem Ölimmersionsobjektiv ausgestattet ist.
Lokalisieren Sie die fluoreszierenden Mikrosphären und passen Sie den Fokus an, um Bildunschärfen zu minimieren.
Verwenden Sie anschließend Durchlicht, um die Bakteriensporen zu lokalisieren.
Wechseln Sie in den SIM-Modus und beleuchten Sie die Sporen, um die Fluorophore anzuregen.
Erfassen Sie hochauflösende Fluoreszenzbilder über die gesamte Sporentiefe.
Auf der lipophilen, farbstoffgefärbten Innenmembran erscheinen die Keimproteine als unterschiedliche rote und grüne Herde. Dies ermöglicht eine präzise Kartierung der Position der Keimproteine innerhalb von Bakteriensporen.
Für die Abbildung der Proben legen Sie den Objektträger auf ein Mikroskop mit strukturierter Beleuchtung, das mit einem 100-fachen Ölobjektiv ausgestattet ist, und fokussieren Sie sich auf die 100-Nanometer-fluoreszierenden Mikrosphären.
Stellen Sie den Korrekturring am 100X-Objektiv ein, bis eine symmetrische Punktspreizungsfunktion erhalten ist, um Unschärfen der Bilder zu minimieren, und wählen Sie ein Sichtfeld mit ca. 10 runden fluoreszierenden Mikrosphären. Wenden Sie eine Gitterfokuseinstellung für die angegebenen Anregungswellenlängen, in diesem Fall 561 und 488 Nanometer, als Leitfaden für die Bildanalysesoftware an, bevor Sie mit dem Transmissionslicht auf die Sporen fokussieren. Nehmen Sie ein Transmissionslichtbild im 16-fachen Durchschnittsmodus mit einer Belichtungszeit von 20 Millisekunden für jedes Bild auf.
Nehmen Sie dann mit dem 3D-SIM-Beleuchtungsmodus fluoreszierende Rohbilder der Sporen mit dem 3D-SIM-Beleuchtungsmikroskop auf.