Aufreinigung von aus Bakterien gewonnenen rekombinanten P-Domänenproteinen des humanen Norovirus

Nehmen Sie eine Größenausschluss-Chromatographiesäule, die mit porösen kugelförmigen Gelkügelchen gefüllt ist.

Äquilibrieren Sie die Säule mit einem Puffer, der die strukturelle Integrität der Proteine während der Trennung bewahrt.

Laden Sie einen gereinigten Bakterienextrakt, der rekombinant exprimierte humane Norovirus-P-Domänenproteine und verbleibende Proteinverunreinigungen enthält.

Fügen Sie den Puffer hinzu, um die Stichprobe durch die Spalte zu leiten.

Große Restverunreinigungen können nicht in die Poren eindringen und durch die Zwischenräume zwischen den Kügelchen gelangen und zuerst eluieren.

Überwachen Sie die Elution mithilfe der UV-Absorption. Ein kleiner Peak zeigt Verunreinigungen an, die aus der Säule austreten.

Im Gegensatz dazu dringen die kleinen Proteine der P-Domäne in die Bead-Poren ein, legen einen längeren Weg zurück und eluieren später. Ein Anstieg des Absorptionspeaks deutet auf die Elution der Proteine der P-Domäne hin.

Sammeln Sie die eluierten Fraktionen, die die Proteine der P-Domäne enthalten, die nun für die weitere Analyse bereit sind.

Waschen Sie die Pumpen und Rohrleitungen des Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-Reinigungssystems und äquilibrieren Sie die Größenausschlusschromatographiesäule mit Gelfiltrationspuffer. Die P-Domäne wird mit einer Flussrate von einem Milliliter pro Minute mit einem Superloop oder einer Schleife auf die Säule injiziert, abhängig vom Volumen der konzentrierten Probe. Erhöhen Sie nach Beendigung der Injektion die Durchflussmenge auf 2,5 Milliliter pro Minute.

Wenn die optische Dichte zunimmt und sich die P-Domäne von der Säule löst, sammeln Sie Fraktionen von 1,5 Millilitern. Die P-Domäne wird normalerweise als Dimer eluiert.