Selektive Aufreinigung eines bakteriellen Proteins durch negative Ionenaustauschchromatographie

Beginnen Sie mit einer Ionenaustauscherharzlösung, die positiv geladene funktionelle Gruppen für die selektive Proteinbindung enthält.

Nehmen Sie als Nächstes einen Proteinextrakt, der aus Wirtsbakterienzellen gewonnen wird, die so verändert wurden, dass sie einen Virulenzfaktor des pathogenen Bakteriums Helicobacter pylori überexprimieren.

Der Extrakt enthält den Zielvirulenzfaktor zusammen mit Wirtszellproteinen in einem Puffer bei pH 8.

Mischen Sie den Proteinextrakt mit dem Harz und inkubieren Sie ihn unter Rühren, um eine gleichmäßige Protein-Harz-Wechselwirkung zu gewährleisten.

Wirtsproteine, deren isoelektrische Punkte niedriger als der pH-Wert des Puffers sind, werden negativ geladen und binden an das positiv geladene Harz.

Das Zielprotein mit einem isoelektrischen Punkt nahe dem pH-Wert des Puffers bleibt weitgehend ungeladen und bleibt ungebunden.

Übertragen Sie die Protein-Harz-Aufschlämmung in eine Chromatographiesäule und lassen Sie das Harz absetzen.

Sammeln Sie die flüssige Phase, die das ungebundene Zielprotein enthält.

Spülen Sie das Harz mit dem Puffer ab, um eine maximale Rückgewinnung des Zielproteins zu gewährleisten.

Zur Herstellung von 15 Millilitern DEAE-Harz suspendieren Sie 0,6 Gramm DEAE-Harz-Trockenpulver in 30 Millilitern Tris-HCl-Puffer bei Raumtemperatur für mindestens einen Tag.

Zentrifugieren Sie das Harz bei 10.000 mal g bei vier Grad Celsius für eine Minute und entfernen Sie dann den Überstand und entsorgen Sie ihn. Fügen Sie dann 15 Milliliter Tris-HCl-Puffer hinzu. Nach Wiederholung der Zentrifugation und viermaliger Resuspensionsschritte lagern Sie die 15 Milliliter abgesetztes Harz bei vier Grad Celsius für die spätere Verwendung.

Bei vier Grad Celsius 45 Milliliter der vorbereiteten löslichen Proteine zu 15 Millilitern des Harzes geben und in ein 100-Milliliter-Becherglas mit Rührstab geben. Rühren Sie die Proteinharzaufschlämmung mit einer Rührplatte bei vier Grad Celsius eine Stunde lang um. Gießen Sie anschließend die Proteinharzaufschlämmung in eine Kunststoff- oder Glassäule, die mit einem Absperrhahn ausgestattet ist, und lassen Sie das Harz unter der Schwerkraft absetzen.

Öffnen Sie den Absperrhahn, damit die Proteinlösung durch die Schwerkraft durch die Säule laufen kann, bis der Flüssigkeitsspiegel in der Säule knapp über dem Harz liegt. Sammeln Sie den Durchfluss als ungebundene Fraktion, die das gereinigte neutrophile aktivierende Protein enthält. Geben Sie 15 Milliliter des eiskalten Tris-HCl-Puffers in die Säule.

Öffnen Sie den Absperrhahn erneut, damit der Waschpuffer durch die Schwerkraft durch die Säule laufen kann, bis der Flüssigkeitsstand in der Säule knapp über dem Harz liegt. Sammeln Sie den Durchfluss als Waschfraktion. Wiederholen Sie das Waschen mit eiskaltem Puffer noch viermal, um die zusätzlichen Waschfraktionen aufzufangen.