Ein Verfahren zur Aufreinigung eines Polyhistidin-markierten Proteins aus Streptococcus mutans

Nehmen Sie eine Kultur von Streptococcus mutans , die ein Polyhistidin-markiertes Protein exprimieren, das in das Medium sezerniert wird.

Zentrifugieren Sie die Kultur und sammeln Sie den proteinreichen Überstand.

Ammoniumsulfat zugeben und unter Rühren inkubieren, um Proteine auszufällen, indem ihre Löslichkeit verringert wird.

Gib die Lösung in ein Röhrchen, zentrifugiere und entsorge den Überstand.

Resuspendieren Sie das Pellet in einem Bindungspuffer, der Salze und niedrigen Imidazolgehalt enthält, um das Protein zu stabilisieren.

Dialysieren Sie die Lösung gegen frischen Bindungspuffer, um überschüssige Salze zu entfernen.

Zentrifugieren Sie die dialysierte Lösung, um unlösliche Rückstände zu pelletieren, und filtrieren Sie dann den Überstand.

Mischen Sie das Filtrat mit nickelgeladenem Affinitätsharz und inkubieren Sie, um eine selektive Bindung des Polyhistidin-markierten Proteins an die Nickelionen zu ermöglichen.

Laden Sie das Gemisch auf die Chromatographiesäule und waschen Sie es mit Bindungspuffer, um ungebundene Proteine zu entfernen.

Als nächstes fügen Sie einen Elutionspuffer mit hohem Imidazolgehalt hinzu, um Histidin aus Nickelionen zu verdrängen und das Polyhistidin-markierte Protein freizusetzen.

Sammeln Sie dieses Eluat, das die gereinigten Proteine enthält.

Zentrifugieren Sie die Bakterienkultursuspension 20 Minuten lang bei 10.000 g bei vier Grad Celsius.

Den Kulturüberstand in ein Drei-Liter-Glasbecherglas umfüllen. Um die Proteine aus dem Kulturüberstand zu konzentrieren, legen Sie den Zwei-Liter-Überstand auf einen Magnetrührer und rühren Sie kräftig um. Fügen Sie 1.122 Gramm Ammoniumsulfat hinzu und lassen Sie den Niederschlag unter kräftigem Rühren bei vier Grad Celsius über einen Zeitraum von 4 Stunden oder über Nacht entstehen.

Als nächstes zentrifugieren Sie die mit Ammoniumsulfat gefällte Lösung bei 15.000 g für 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Dekantieren Sie den Überstand. Sammeln Sie den Niederschlag mit einem Spatel und geben Sie ihn in ein 200-Milliliter-Glasbecherglas.

Die Pellets werden in 35 Millilitern Bindepuffer resuspendiert. Übertragen Sie dann jeweils etwa 25 Milliliter der Suspension in einen Dialyseschlauch aus regenerierter Zellulose. Legen Sie den Dialyseschlauch in 2,5 Liter des Rührpuffers auf einem Rührer bei vier Grad Celsius, um die Suspension zu dialysieren.

Ersetzen Sie die Dialyselösung nach zwei Stunden und setzen Sie die Dialyse über Nacht fort. Übertragen Sie anschließend die dialysierte Suspension aus dem Schlauch in die Zentrifugenröhrchen und legen Sie die Röhrchen bei 20.000 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius in die Zentrifuge. Gießen Sie den Überstand mit einer Saugfiltrationsanlage über einen 0,2-Mikrometer-Membranfilter, um ihn zu filtrieren.

Das Filtrat wird in einen 75-Milliliter-Kolben überführt.

Um das Polyhistidin-markierte gtfSI aus der filtrierten Suspension zu fraktionieren, wird zunächst eine immobilisierte Metallaffinitätschromatographie hergestellt. Nachdem Sie das Harz gemäß dem Manuskript ausgeglichen haben, schließen Sie den Hoffman-Quetschhahn.

Geben Sie fünf Milliliter der gefilterten Suspension in die Säule, um eine Aufschlämmung herzustellen. Übertragen Sie dann die gesamte Aufschlämmung in die restliche gefilterte Suspension und schwenken Sie die Mischung 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Laden Sie das Gemisch zurück in die Säule.

Öffnen Sie den Hoffman-Quetschhahn, um die Suspension durch die Schwerkraft zu entfernen. Waschen Sie das IMAC-Harz mit 20 Millilitern Bindungspuffer und eluieren Sie dann 20 Milliliter Elutionspuffer, um das rekombinante gtfSI zu erhalten.