Ein Verfahren zur Aufreinigung eines Polyhistidin-markierten Proteins aus Streptococcus mutans

Nehmen Sie eine Kultur von Streptococcus mutans , die ein Polyhistidin-markiertes Protein exprimieren, das in das Medium sezerniert wird.

Zentrifugieren Sie die Kultur und sammeln Sie den proteinreichen Überstand.

Ammoniumsulfat zugeben und unter Rühren inkubieren, um Proteine auszufällen, indem ihre Löslichkeit verringert wird.

Gib die Lösung in ein Röhrchen, zentrifugiere und entsorge den Überstand.

Resuspendieren Sie das Pellet in einem Bindungspuffer, der Salze und niedrigen Imidazolgehalt enthält, um das Protein zu stabilisieren.

Dialysieren Sie die Lösung gegen frischen Bindungspuffer, um überschüssige Salze zu entfernen.

Zentrifugieren Sie die dialysierte Lösung, um unlösliche Rückstände zu pelletieren, und filtrieren Sie dann den Überstand.

Mischen Sie das Filtrat mit nickelgeladenem Affinitätsharz und inkubieren Sie, um eine selektive Bindung des Polyhistidin-markierten Proteins an die Nickelionen zu ermöglichen.

Laden Sie das Gemisch auf die Chromatographiesäule und waschen Sie es mit Bindungspuffer, um ungebundene Proteine zu entfernen.

Als nächstes fügen Sie einen Elutionspuffer mit hohem Imidazolgehalt hinzu, um Histidin aus Nickelionen zu verdrängen und das Polyhistidin-markie