Quantifizierung koloniebildender Einheiten darmassoziierter Bakterien in Drosophila-Fliegen

Beginnen Sie mit einer Mikroplatte mit Homogenaten, die aus Drosophila-Fliegen hergestellt wurden. Diese Fliegen beherbergten eine kontrollierte Population eines bestimmten Bakteriums in ihrem Darm.

Die Homogenate enthalten lysiertes Fliegengewebe und freigesetzte Darmbakterien.

Aspirieren Sie die suspendierten Bakterien und verdünnen Sie sie seriell über mehrere Mikroplatten.

Erkennen Sie kleine Volumina aus jeder Verdünnung auf Agarplatten und stellen Sie sicher, dass die Tröpfchen getrennt bleiben.

Inkubieren, damit sich Bakterien in sichtbare Kolonien vermehren können.

Nehmen Sie Bilder der Platten auf, um koloniebildende Einheiten (KBE) zu quantifizieren, die die Anzahl lebensfähiger Bakterienzellen darstellen, die in der Lage sind, einzelne Kolonien zu bilden.

Richten Sie mit Hilfe einer Bildanalysesoftware jedes Bild anhand einer Referenzlinie aus, definieren Sie eine Begrenzung und wenden Sie ein einheitliches Raster an, um es in Zählzonen zu segmentieren, die jeweils einem einzelnen Punkt entsprechen.

Passen Sie den Helligkeitsschwellenwert an, um einzelne Kolonien vom Hintergrund zu unterscheiden, und führen Sie dann die Analyse aus, um die Kolonien an jedem Punkt zu zählen und die KBE zu quantifizieren.

Legen Sie drei rechteckige MRS-Agar-Wachstumsplatten mit geöffneten Deckeln in die Biosicherheitswerkbank, um sie mindestens 10 Minuten lang zu trocknen. Bereiten Sie zwei Verdünnungsplatten vor, indem Sie 100 Mikroliter PBS mit einer 96-Kanal-Pipetette in jede Vertiefung einer sterilen 96-Well-Platte geben. Legen Sie ein Gestell mit P-20-Spitzen auf die 96-Kanal-Pipette.

Eine Verdünnung im Verhältnis 1:10 wird durch Ansaugen von 11,1 Mikrolitern Homogenat aus der Probenplatte vorgenommen. Geben Sie es nun in die erste Verdünnungsplatte, die 100 Mikroliter steriles PBS pro Vertiefung enthält. Halten Sie die Verdünnungsplatte 10 Sekunden lang bei 600 U/min auf dem Plattenschüttler.

Mischen Sie erneut, indem Sie mindestens 10 Mal auf und ab pipettieren. Übertragen Sie 11,1 Mikroliter von der ersten Verdünnungsplatte auf die zweite Verdünnungsplatte und wiederholen Sie die Mischschritte für alle weiteren Verdünnungen. Für Schmierplatten geben Sie zwei Mikroliter aus jeder Vertiefung in die 96-Kanal-Pipette.

Senken Sie den Pipettenkopf langsam auf die Platte, vermeiden Sie ein Stechen in den Agar und stellen Sie sicher, dass alle Flecken ausgegeben wurden. Überprüfen Sie dann, ob die flüssigen Flecken schnell in den Agar eindringen und nicht zusammenlaufen. Wiederholen Sie den Beschichtungsvorgang für die verbleibenden Verdünnungsplatten, wie im Manuskript beschrieben.

Sobald die Flüssigkeit vollständig in den Agar aufgenommen wurde, drehen Sie die Platten um und inkubieren Sie sie, bis die Kolonien die optimale Größe erreicht haben. Ordnen Sie die Platten logisch an und halten Sie sie während des Fotografierens in einer bestimmten Reihenfolge. Richten Sie sie so aus, dass sich A1 für alle Platten in der oberen linken Ecke befindet.

Nachdem Sie den Tellerdeckel entfernt haben, stellen Sie die Platte mit A1 in der richtigen Ecke auf den Tisch. Stellen Sie sich die Platten vor. Übertragen Sie die Bilder auf einen Computer und benennen Sie sie um, einschließlich des Namens des Experiments, des Medientyps, des Verdünnungsfaktors und anderer relevanter Details.

Organisieren Sie die Bilder, die für die Quantifizierung verarbeitet werden sollen, in einem Ordner. Die Dateinamen, die die Platten unterscheiden, werden zu Spaltentiteln für jeden Satz von Zählungen in der Ausgabetabelle. Erstellen Sie Unterordner mit den Namen "Zugeschnitten" und "Quittungen" in dem Ordner.

Diese Ordner erhalten die Ausgabedateien. Starten Sie nun das Croptacular-Plugin von ImageJ und klicken Sie auf OK, um mit dem Zuschneiden zu beginnen. Es öffnet sich ein Dialogfeld zur Auswahl des Quellordners.

Klicken Sie auf OK. Wählen Sie den Quellordner aus und klicken Sie auf Öffnen. Klicken Sie dann im Dialogfeld zur Auswahl des Zielverzeichnisses auf OK. Wählen Sie den Zielordner aus und drücken Sie Öffnen.

Wenn das Bild bereits gerade ist, drücken Sie einfach die Leertaste. Andernfalls begradigen Sie das Bild, indem Sie eine Linie entlang einer Kante zeichnen, die horizontal werden soll. Zeichnen Sie die Linie so oft wie nötig neu, wenn das Bild nicht gerade erscheint.

Zeichnen Sie als Nächstes einen Begrenzungsrahmen für den Zählbereich und passen Sie dessen Größe und Proportion an, bis sich alle Punkte innerhalb ihrer Zellen befinden. Ziehen Sie den Cursor außerhalb des Begrenzungsfelds, um das Raster zu aktualisieren. Wenn das Raster gut aussieht, drücken Sie die Leertaste.

Da das Plugin davon ausgeht, dass alle Fotos identisch ausgerichtet sind, stellen Sie sicher, dass sich das nächste Bild automatisch in den gleichen Winkel wie das erste dreht. Wenn dies zutrifft, drücken Sie die Leertaste, um fortzufahren. Andernfalls richten Sie das Bild wie zuvor aus.

Das Raster erinnert sich auch an die gleiche Position wie im vorherigen Bild. Passen Sie bei Bedarf an und drücken Sie die Leertaste. Starten Sie Count-On-It und wählen Sie Gridiron.

Legen Sie die Schwellenwert-Kolonieintensität basierend auf einem oberen und einem unteren Pixelintensitätswert fest. Legen Sie den Schwellenwert so streng wie möglich fest und wählen Sie dennoch alle Völker aus. Klicken Sie im Dialogfeld "Aktion erforderlich" auf OK, wenn der Schwellenwert zufriedenstellend ist, und klicken Sie dann auf OK, um fortzufahren.

Auf dem ersten Bild gibt es die Option, fortzufahren oder zum Setup-Menü zurückzukehren. Um mit dem Batch-Vorgang fortzufahren, klicken Sie auf OK. Wählen Sie dann einen Ordner aus, in dem die Beleg- und Ergebnistabelle aufbewahrt werden soll. Verwenden Sie den Ordner "Quittungen", der zuvor erstellt wurde.

Nach dem ersten Bild wird für die folgenden Bilder standardmäßig der gleiche Schwellenwert wie in den vorherigen Einstellungen verwendet. Klicken Sie auf OK, um diese Einstellungen zu verwenden oder die Einstellungen anzupassen.