Behandlung von Bakterien mit Ausscheidungen aus Pflanzenwurzeln zur Emulation von In-vitro-Wechselwirkungen zwischen Pflanzen und Mikroben

Nehmen Sie eine Stammkultur von Bacillus mycoides, einem pflanzenwachstumsfördernden Rhizobakterium, und streichen Sie ein Inokulum auf eine Kulturplatte.

Inkubieren Sie die Platte, um die bakterielle Vermehrung in Kolonien zu fördern.

Impfen Sie eine einzelne Kolonie in ein flüssiges Medium und inkubieren Sie sie durch Schütteln, um das Bakterienwachstum zu fördern.

Verdünnen Sie die Kultur mit dem flüssigen Medium, um die optimale Dichte für den Assay zu erreichen.

Fügen Sie der Kultur Kartoffelwurzelexsudate hinzu, um Pflanzen-Mikroben-Interaktionen zu emulieren.

Inkubieren Sie die Kultur unter Rühren, um die Interaktion der Signalmoleküle mit bakteriellen Rezeptoren zu erleichtern.

Diese Interaktion induziert Signalwege, die regulatorische Proteine aktivieren, die an die DNA binden und die Genexpression verändern.

Übertragen Sie die Kultur in ein Röhrchen und schleudern Sie die Bakterienzellen zu einem Pellet herunter.

Entsorgen Sie den Überstand und tauchen Sie das Röhrchen in flüssigen Stickstoff, um die Zellen schockfrosten zu lassen.

Lagern Sie die Zellen, um durch das Exsudat der Pflanzenwurzel induzierte Veränderungen der bakteriellen Genexpression zu analysieren.

Um die Bakterien zu züchten, streift man einen B. mycoides-Stamm aus einem minus 80 Grad Celsius heißen Glycerinstamm auf eine LB-Agarplatte und inkubiert die Platte über Nacht bei 30 Grad Celsius. Beimpfen Sie dann das flüssige LB-Medium mit einer einzigen Kolonie von der Platte und züchten Sie die Kultur in einem Schüttelbrutkasten bei 200 U/min über Nacht bei 30 Grad Celsius.

Zur Behandlung und Probenahme der Bakterien wird eine B. mycoides-Kultur über Nacht mit 90 Millilitern vorgewärmtem LB-Medium auf den anfänglichen OD₆₀₀ von null Komma fünf in einem 300-Milliliter-Kolben verdünnt. Geben Sie anschließend 10 Milliliter Wurzelexsudat in die Kultur und verwenden Sie eine 10 Milliliter sterile, deionisierte Wasseraufbereitung als Kontrolle. Dann inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei 30 Grad Celsius.

Nach einer Stunde die Kultur in 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführen. Sammeln Sie die Zellen aus der Kultur, indem Sie zwei Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 9.000 Mal G zentrifugieren. Entsorgen Sie anschließend den Überstand und frieren Sie das Pellet sofort in flüssigem Stickstoff ein.

Anschließend bis zur Verwendung bei minus 80 Grad Celsius lagern.