Detektion der Oberflächenmetalltransporter in Neisseria gonorrhoeae mittels Dot Blot

Beginnen Sie mit einer Neisseria gonorrhoeae-Kultur , die in einem metallarmen Medium gezüchtet wird.

Metallknappheit löst die Expression von Transportern der äußeren Membran aus, die die Metallaufnahme initiieren, sofern verfügbar.

Legen Sie eine vorgetränkte Nitrozellulosemembran auf feuchtes Filterpapier und bauen Sie das Dot-Blot-Gerät zusammen.

Erkennen Sie die Bakterienzellen und lassen Sie die Flüssigkeit einziehen.

Zerlegen Sie das Gerät, entfernen Sie die Membran und trocknen Sie es an der Luft.

Fügen Sie einen Blockierungsagenten hinzu, um unspezifische Bindungen zu verhindern.

Setzen Sie die Membran wieder in das Gerät ein, versiegeln Sie sie mit Parafilm und bauen Sie sie wieder zusammen.

Fügen Sie einen vom Wirt abgeleiteten metallbindenden Liganden hinzu und inkubieren Sie durch Schütteln.

Der Ligand bindet an die bakteriellen Transporter.

Entfernen Sie die Flüssigkeit und waschen Sie die Membran, um ungebundene Liganden zu entfernen.

Fügen Sie einen ligandenspezifischen Primärantikörper hinzu, gefolgt von einem enzymkonjugierten Sekundärantikörper und einem kolorimetrischen Nachweisreagenz, das ein farbiges Produkt bildet.

Ein sichtbares Signal zeigt die Expression von bakterie