Detektion der Oberflächenmetalltransporter in Neisseria gonorrhoeae mittels Dot Blot

Beginnen Sie mit einer Neisseria gonorrhoeae-Kultur , die in einem metallarmen Medium gezüchtet wird.

Metallknappheit löst die Expression von Transportern der äußeren Membran aus, die die Metallaufnahme initiieren, sofern verfügbar.

Legen Sie eine vorgetränkte Nitrozellulosemembran auf feuchtes Filterpapier und bauen Sie das Dot-Blot-Gerät zusammen.

Erkennen Sie die Bakterienzellen und lassen Sie die Flüssigkeit einziehen.

Zerlegen Sie das Gerät, entfernen Sie die Membran und trocknen Sie es an der Luft.

Fügen Sie einen Blockierungsagenten hinzu, um unspezifische Bindungen zu verhindern.

Setzen Sie die Membran wieder in das Gerät ein, versiegeln Sie sie mit Parafilm und bauen Sie sie wieder zusammen.

Fügen Sie einen vom Wirt abgeleiteten metallbindenden Liganden hinzu und inkubieren Sie durch Schütteln.

Der Ligand bindet an die bakteriellen Transporter.

Entfernen Sie die Flüssigkeit und waschen Sie die Membran, um ungebundene Liganden zu entfernen.

Fügen Sie einen ligandenspezifischen Primärantikörper hinzu, gefolgt von einem enzymkonjugierten Sekundärantikörper und einem kolorimetrischen Nachweisreagenz, das ein farbiges Produkt bildet.

Ein sichtbares Signal zeigt die Expression von bakteriellen Metalltransportern unter metallbegrenzten Bedingungen an.

Nach der Massenverdopplungsinkubation verdünnen Sie die Kulturen mit drei Volumina CDM. Dann inkubieren Sie die Kulturen bei 37 Grad Celsius und schütteln vier Stunden lang. Kurz vor der Vier-Stunden-Marke schneiden Sie drei Stücke Filterpapier und ein Stück Nitrozellulose auf die ungefähre Größe zu, die für einen Dot-Blot-Apparat erforderlich ist.

Weichen Sie die Nitrozellulose etwa 10 Minuten lang in entionisiertem Wasser ein, bevor Sie das Gerät mit Filterpapier unter der Nitrozellulose zusammenbauen. Erfassen Sie am Ende der Inkubation die Zelldichten und standardisieren Sie die Dichten auf eine geeignete Enddichte. Pipettieren Sie dann die Zellkulturen auf die Nitrozellulose.

Wenn das Filterpapier die gesamte Flüssigkeit aufgesaugt hat, zerlegen Sie das Gerät und lassen Sie den Fleck trocknen. Blockieren Sie die Nitrozellulosemembran eine Stunde lang mit einer geeigneten Blockierungslösung, bauen Sie das Dot-Blot-Gerät wieder zusammen, indem Sie das Filterpapier durch Paraffinfolie ersetzen, um eine auslaufsichere Abdichtung unter der Nitrozellulose zu schaffen. Verdünnen Sie den interessierenden metallbindenden Liganden im Blocker auf 0,2 Mikromolar und sondieren Sie die Zellen eine Stunde lang unter mäßigem Schütteln.

Am Ende der Inkubation saugen Sie die Flüssigkeit mit einem Vakuum ab, waschen Sie den Blot und befolgen Sie die immunologischen Standardverfahren, um das Signal zu entwickeln.