Messung der Fehltranslationsraten von Mycobacterium smegmatis mit einem GFP/Luciferase-Reportersystem

Nehmen Sie eine Kultur von Mycobacterium smegmatis , die induzierbare Gene für GFP und eine sekretionssignalmarkierte mutierte Luciferase enthält.

Das mutierte Gen kodiert für eine inaktive Luciferase, aber eine natürliche Fehltranslation während der Proteinsynthese erzeugt ein aktives Enzym.

GFP dient als interne Kontrolle zur Normalisierung der Luziferase-Expression.

Fügen Sie den Induktor hinzu, um die Genexpression zu initiieren, und aliquotieren Sie die Kultur dann in eine Multi-Well-Platte.

Führen Sie steigende Konzentrationen eines Testmoleküls in ausgewählte Vertiefungen ein. Ausbrüten.

Unter Kontrollbedingungen führt eine Fehltranslation zu einer aktiven Luciferase-Sekretion.

Hemmt das Testmolekül die Fehltranslation, nimmt die aktive Luciferase-Sekretion ab.

Übertragen Sie die Kulturaliquote auf eine schwarze Platte und messen Sie die GFP-Fluoreszenz.

Zentrifugieren Sie, um die Zellen zu pelletieren.

Übertragen Sie die Überstände, die sezernierte Luciferase enthalten, und fügen Sie das Substrat hinzu, wobei aktive Luciferase ihre Oxidation katalysiert und Lumineszenz erzeugt.

Messung der Lumineszenz und Berechnung des Luziferase/GFP-Verhältnisses; Ein niedrigeres Verhältnis deutet auf eine verringerte Fehltranslation aufgrund des Testmoleküls hin.

Beimpfen Sie zunächst zwei Milliliter 7H9-Medium mit dem bakteriellen Reporterstamm.

Schütteln Sie bei 37 Grad Celsius für ein bis zwei Tage oder bis der OD bei 600 Nanometern die stationäre Phase erreicht.

Dann Subkultur in 50 Millilitern 7H9-Medium und wachsen, bis der OD bei 600 Nanometern die späte stationäre Phase erreicht. Bevor Sie die Bakterien auf eine 96-Well-Platte aliquotieren, fügen Sie ATC in einer Endkonzentration von 50 Nanogramm pro Milliliter hinzu und mischen Sie es gut.

Geben Sie 100 Mikroliter pro Vertiefung in eine durchsichtige 96-Well-Platte mit rundem Boden. Geben Sie als Nächstes verschiedene Dosen von Ksg in ausgewählte Vertiefungen, um seine Auswirkungen auf die Fehltranslationsraten zu untersuchen. Geben Sie 200 Mikroliter steriles Wasser in die Randvertiefungen der Platte, um die Verdunstung aus den Probenvertiefungen zu begrenzen.

Verschließen Sie die Platte, schütteln Sie sie und induzieren Sie die Proben 16 bis 20 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 80 Mikroliter aus jeder Vertiefung zu entnehmen. Übertragen Sie die Proben auf eine 96-Well-Platte mit schwarzem Boden und messen Sie das GFP-Signal mit dem Luminometer.

Nach der Messung des GFP-Signals zentrifugieren Sie die Platte 10 Minuten lang bei 3.220 mal g. Übertragen Sie dann 50 Mikroliter des Überstands auf eine 96-Well-Platte mit weißem Boden.

Geben Sie dann 50 Mikroliter Nluc-Substrat in jede Vertiefung, mischen Sie sie gut und messen Sie die Lumineszenz mit dem Luminometer. Bestimmen Sie abschließend das Nluc/GFP-Verhältnis, indem Sie den korrigierten Nluc-Lumineszenzwert durch die GFP-Fluoreszenz dividieren.