Messung der Fehltranslationsraten von Mycobacterium smegmatis mit einem GFP/Luciferase-Reportersystem

Nehmen Sie eine Kultur von Mycobacterium smegmatis , die induzierbare Gene für GFP und eine sekretionssignalmarkierte mutierte Luciferase enthält.

Das mutierte Gen kodiert für eine inaktive Luciferase, aber eine natürliche Fehltranslation während der Proteinsynthese erzeugt ein aktives Enzym.

GFP dient als interne Kontrolle zur Normalisierung der Luziferase-Expression.

Fügen Sie den Induktor hinzu, um die Genexpression zu initiieren, und aliquotieren Sie die Kultur dann in eine Multi-Well-Platte.

Führen Sie steigende Konzentrationen eines Testmoleküls in ausgewählte Vertiefungen ein. Ausbrüten.

Unter Kontrollbedingungen führt eine Fehltranslation zu einer aktiven Luciferase-Sekretion.

Hemmt das Testmolekül die Fehltranslation, nimmt die aktive Luciferase-Sekretion ab.

Übertragen Sie die Kulturaliquote auf eine schwarze Platte und messen Sie die GFP-Fluoreszenz.

Zentrifugieren Sie, um die Zellen zu pelletieren.

Übertragen Sie die Überstände, die sezernierte Luciferase enthalten, und fügen Sie das Substrat hinzu, wobei aktive Luciferase ihre Oxidation katalysiert und Lumineszenz erzeugt.

Messung der Lumineszenz und Berechnung des Luziferase/GFP-Verhältnisses; Ein niedrigeres Verhältnis deutet