JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiologie
0 Ansichten • 2:17 Min. • October 30th, 2025
Beginnen Sie mit einer euthanasierten Maus mit freiliegender Luftröhre. Die Lungen der Maus waren mit dem nicht typisierbaren Haemophilus influenzae, einem pathogenen Bakterium, vorinfiziert.
Führen Sie einen Katheter in die Luftröhre ein und befestigen Sie ihn an einer mit Waschpuffer gefüllten Spritze.
Verabreichen Sie den Waschpuffer, der ein Antikoagulans enthält, um die Bildung von Blutgerinnseln zu verhindern, und einen Zucker, um die Zellintegrität zu erhalten.
Sanft aspirieren, um die bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit zurückzugewinnen, die rote Blutkörperchen, Immunzellen und verbleibende Krankheitserreger enthält.
Wiederholen Sie den Vorgang und poolen Sie die zurückgewonnene Spülflüssigkeit in einer einzigen Suspension.
Entnehmen Sie ein Aliquot aus der gepoolten Suspension und zentrifugieren Sie, um die Zellen zu trennen. Entsorgen Sie den Überstand.
Resuspendieren Sie die Zellen in einem Lysepuffer, um die roten Blutkörperchen selektiv zu lysieren.
Zentrifugieren Sie, um die verbleibenden Zellen zu trennen, und entsorgen Sie den Überstand mit den Ablagerungen.
Setzen Sie die verbleibenden Zellen in einem Puffer erneut ein.
Die endgültige Suspension, die Immunzellen und Restbakterien enthält, ist bereit für die nachgelagerte Analyse.
Legen Sie den ventralen Teil der Lunge frei, um Zugang zur Luftröhre zu erhalten. Intubieren Sie die Luftröhre mit einem 20-Gauge-Katheter.
Mit dem Katheter 0,8 Milliliter BALF-Puffer einträufeln und die Spülung durch Zahnaspiration auffangen. Wiederholen Sie diesen Vorgang noch dreimal, indem Sie die vier Lava-Kollektionen in einer einzigen Suspension zusammenfassen.
Nehmen Sie ein 100-Mikroliter-Aliquot und schleudern Sie es zwei Minuten lang bei 2.000 U/min.
Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie ihn in Erythrozyten-Lysepuffer. Schleudern Sie es herunter und resuspendieren Sie das Pellet mit 1X PBS.