Extraktion und Reinigung von Plastoglobuli aus photosynthetischen Bakterien

Beginnen Sie mit einer Kultur von Cyanobakterien, bei denen es sich um photosynthetische Bakterien handelt.

Diese Bakterien enthalten lipidreiche Plastoglobuli-Tröpfchen und Thylakoidmembranen, bei denen es sich um gefaltete membranöse Strukturen handelt, die reich an photosynthetischen Pigmenten sind.

Zentrifugieren Sie die Kultur und verwerfen Sie den Überstand, um von Bakterien produzierte extrazelluläre Polysaccharide zu entfernen. Waschen Sie das Pellet und suspendieren Sie es dann wieder in einem Puffer.

Verwenden Sie einen Hochdruck-Homogenisator, um eine Scherkraft zu erzeugen, die Zellwände und Membranen aufbricht.

Durch den Bruch der Thylakoidmembranen werden photosynthetische Pigmente in das Lysat freigesetzt. Die Freisetzung von Pigmenten bewirkt eine Farbveränderung, die auf einen Zellaufschluss und eine Freisetzung von Plastoglobuli hinweist.

Laden Sie das Lysat in Zentrifugenröhrchen und fügen Sie dann eine Saccharoselösung hinzu, um einen Dichtegradienten zu bilden.

Zentrifuge, um zelluläre Bestandteile nach Dichte zu trennen.

Das Thylakoid und andere schwerere Bestandteile pelletieren an der Unterseite, während die Plastoglobuli mit geringer Dichte als deutliches Band nach oben schwimmen.

Entnehmen Sie die Plastoglobuli-Fraktion und lagern Sie sie durch Einfrieren für die weitere Analyse.

Züchten Sie 50 Milliliter der Synechocystis-Spezies PCC 6802 für 7 bis 10 Tage in BG11-Medien, um die stationäre Phase zu erreichen.

Stellen Sie die Zelldichte mit einem Spektralphotometer auf eine optische Dichte von 2,0 bei 750 Nanometern ein. Um die Polysaccharide zu entfernen, zentrifugieren Sie 50 Milliliter Kultur und entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie das Waschen der Zellen in 50 Millilitern Puffer A zweimal.

Resuspendieren Sie das gewaschene Pellet in 25 Millilitern Puffer A und brechen Sie die Zellen mit einer französischen Druckzelle bei 1.100 Pfund Quadratzoll. Wiederholen Sie den Vorgang dreimal unter kalten Bedingungen, bis sich die lysierte Farbe unter weißem Licht von grün zu rot-blaugrün ändert. Entfernen Sie das Aliquot des Zellhomogenats und legen Sie es beiseite, um es als repräsentative Gesamtzellprobe zu lagern.

Das resultierende Homogenat wird in acht Drei-Milliliter-Ultrazentrifugenröhrchen verteilt, die mit maximal 2,5 Millilitern in jedem Röhrchen gefüllt sind. Überlagern Sie dieses Homogenat mit 400 Mikrolitern Medium R, wodurch ein Stufengradient entsteht. Gleichen Sie die Röhrchen vorsichtig aus, indem Sie bei Bedarf zusätzliches Medium R hinzufügen, bevor Sie die Röhrchen zentrifugieren.

Das Thylakoid und andere schwerere Organellen, einschließlich aller Polyhydroxyalkanoatkörper, zeigen eine Pelletbildung, während Plastoglobuli ein gelbes öliges Polster auf oder in der Nähe der Oberseite des Saccharosegradienten bilden. Ernten Sie das entstandene schwimmende Pad aus rohen Plastoglobuli mit einer Spritze und geben Sie die Ernte in ein Zwei-Milliliter-Röhrchen.

Kratzen Sie bei Bedarf Plastoglobuli seitlich mit einer Nadelspitze von der Wand des Ultrazentrifugenröhrchens ab. Fahren Sie entweder mit der Verarbeitung von Cyanobakterien fort oder lagern Sie rohe Plastoglobuli bei minus 80 Grad Celsius und reinigen Sie sie später.