JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiologie
0 Ansichten • 2:03 Min. • October 30th, 2025
Beginnen Sie mit einer Kultur von Legionella pneumophila, einem pathogenen Bakterium.
Diese Bakterienzellen besitzen auf ihrer Membran ein Sekretionssystem, das für die Infektion des Wirts unerlässlich ist.
Suspendieren Sie die Bakterienzellen in sterilem Wasser, um die erforderliche Dichte für die kryogene Elektronentomographie (Kryo-ET) zu erreichen.
Fügen Sie Goldnanopartikel hinzu, die als Referenzpunkte für die Bildausrichtung bei der dreidimensionalen Rekonstruktion dienen.
Nehmen Sie ein Gitter mit einem perforierten Kohlenstofffilm, um die Bakterienprobe abzugeben.
Legen Sie das Gitter in eine gasgefüllte Kammer und wenden Sie eine elektrische Entladung an, um die Oberfläche hydrophiler zu machen.
Tragen Sie die Suspension auf das Gitter auf, so dass sich die Flüssigkeit gleichmäßig auf der Oberfläche verteilen und sich die Zellen absetzen können.
Entfernen Sie überschüssiges Wasser aus dem Gitter und tauchen Sie es in ein flüssiges Gefriermedium, um die Probe einzufrieren und ihre zelluläre Architektur zu erhalten.
Die Probe ist nun bereit für die Kryo-ET-Bildgebung des bakteriellen Sekretionssystems.
Zur Vorbereitung der Elektronenkryotomographie-Probe züchten Sie einen schweren Fleck Legionella Pneumophila 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius auf CYE-Agar-Streptomycin-Platten.
Resuspendieren Sie die Zellen in Wasser auf einen OD600 von etwa 0,7. Geben Sie dann fünf Mikroliter kolloidale Goldpartikel zu 20 Mikrolitern der Zellsuspension. Glühen, entladen Sie ein löchriges Kohlenstoffgitter und pipettieren Sie fünf Mikroliter des Zellgemisches darauf.
Eine Minute stehen lassen. Tupfen Sie das Gitter mit Filterpapier ab und frieren Sie es mit einem schwerkraftbetriebenen Kolben in flüssigem Ethan ein.