Generierung von Antibiotika-markierten Mutanten in Cyanobakterien durch homologe Rekombination

Beginnen Sie mit einer Kultur von Cyanobakterien.

Zentrifugieren Sie die Kultur und waschen Sie das Pellet vorsichtig, um die bakterielle Oberfläche der Pili zu erhalten.

Erneut zentrifugieren, das Pellet in frischem Medium resuspendieren und in ein Röhrchen umfüllen.

Führen Sie einen nicht-replizierenden Vektor mit einem Antibiotikaresistenzgen ein. Dieses Gen wird von DNA-Sequenzen flankiert, die homolog zu Regionen sind, die sich strom- und stromabwärts eines Zielgens im bakteriellen Genom befinden.

Inkubieren, um eine Pili-vermittelte Internalisierung des Plasmids zu ermöglichen, die sich an den homologen Sequenzen orientiert und das Zielgen durch Rekombination ersetzt, wodurch eine Mutation eingeführt wird.

Verteilen Sie die Zellen auf Agar und inkubieren Sie, so dass das Antibiotikaresistenzgen ein Resistenzprotein exprimieren kann.

Die Agaroberfläche mit Agar beschichten, der ein Antibiotikum enthält, und inkubieren. Das Resistenzprotein in mutierten Zellen inaktiviert das Antibiotikum und erleichtert so deren Überleben und Koloniebildung.

Wählen Sie die überlebenden Kolonien aus und streichen Sie erneut auf Agar, der ein Antibiotikum enthält, um die antibiotikaresistenten Mutanten