Induzierbare Expression von histidin-markiertem Ricintoxin A-Kette in E. coli
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Mikrobiologie
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Beginnen Sie mit E.-coli-Kolonien , die ein vom LAC-Operator reguliertes T7-Polymerase-Gen und ein expressionsplasmid enthalten.
Das Plasmid trägt Gene für Antibiotikaresistenz und die Ricintoxin-A-Kette.
Das Resistenzgen wird konstitutiv exprimiert und erzeugt ein Antibiotikaresistenzprotein.
Das RTA-Gen ist histidin markiert und reguliert von einem T7-Promotor und einem LAC-Operator.
Inokulieren Sie die Kolonien in antibiotika-supplementierte Medien und inkubieren Sie mit Schütteln.
Das Antibiotikaresistenzprotein inaktiviert das Antibiotikum und ermöglicht so das selektive Wachstum plasmidtragender Bakterien.
Die Kultur wird in antibiotika-gestützte Medien übertragen und mit Schütteln inkubiert, um das Bakterienwachstum zu fördern.
Senken Sie die Kulturtemperatur, um die richtige Faltung des RTA-Proteins zu verbessern.
Fügen Sie einen Induktor hinzu, um die Lac-Repression zu lindern. Dies löst die Expression der T7-Polymerase aus und initiiert die RTA-Transkription und Proteinsynthese.
Zentrifuge, um die Bakterien zu sammeln und das Supernatant zu entsorgen.
Waschen Sie mit einem Puffer, zentrifugieren Sie und entfernen Sie das Supernatant.
Suspendieren Sie die His-markierten, RTA-exprimie
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