JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiologie
0 Ansichten • 3:09 Min. • November 28th, 2025
Nehmen Sie eine genetisch veränderte E. coli-Kultur , die ein chromosomales Tetracyclin-Operator-(tetO)-Array exprimiert.
Die Bakterien tragen außerdem ein Plasmid mit einem arabinose-induzierbaren Promotor, der die Expression des YFP-markierten Tetracyclin-Repressorproteins antreibt.
Die Kultur wird in ein angereichertes Nährmedium mit Antibiotika übertragen und durch Schütteln inkubiert, um plasmidführende Zellen auszuwählen.
Während die Zellen wachsen, bilden sich Replisome und initiieren die Replikation der chromosomalen DNA.
In der exponentiellen Phase wird ein Teil als uninduzierte Kontrolle aufgenommen.
Fügen Sie der verbleibenden Kultur Arabinose, einen Induktor, hinzu und inkubieren Sie beide Kulturen mit Schütteln.
In der nicht induzierten Kultur bleibt das AraC-Dimer an die DNA-Schleife gebunden und hemmt die Expression des Repressors.
In der induzierten Kultur bindet sich Arabinose an den AraC-Dimer und induziert so die Expression des Repressors.
Die Repressorproteine binden an das chromosomale TetO-Array und stoppen so den Fortschreiten der Replikationsgabel.
Verwenden Sie eine Fluoreszenzmikroskopie, um beide Kulturen zu beobachten.
Fluoreszierende Brennpunkte in der induzierten E.-coli-Kultur bestätigen eine repressorproteinvermittelte Replikationsblockade.
Für dieses Verfahren wird ein E.-coli-Stamm mit einem Tetracyclin-Operator-Array im pKM1-Plasmid verwendet. pKM1 codiert für TetR-YFP, ein induzierbares, gelb fluoreszierendes Protein-markiertes Tetracyclin-Repressorprotein.
Verdünnen Sie eine frische, über Nacht durchgeführte Kultur dieses E.-coli-Stamms auf eine optische Dichte von 600 Nanometern von 0,01 in einem verdünnten Komplexmedium mit Antibiotika, wie für die Selektion erforderlich. Wachsen Sie die Kultur bei 30 Grad Celsius mit dem Schütteln auf eine optische Dichte bei 600 Nanometern von 0,05 bis 0,1. Entnehmen Sie eine 10-Milliliter-Probe, die als uninduzierte Kontrolle dient.
Fügen Sie 0,01 % Arabinose zur restlichen Kultur hinzu, um die Produktion von TetR-YFP aus pKM1 zu induzieren. Lassen Sie weiterhin sowohl die nicht induzierten als auch die induzierten Kulturen bei 30 Grad Celsius mit Schütteln wachsen. Nach einer Stunde wird in jeder Zelle der induzierten Kultur mit Fluoreszenzmikroskopie auf einen einzelnen Brennpunkt überprüft.
Wenn die induzierten Zellen als blockiert bestätigt werden, was darauf hindeutet, dass mehr als 70 % der Zellen nur einen Fokus haben, wird die optische Dichte erfasst und 7,5 Milliliter der Probe zur Analyse mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese entnommen. Entnehmen Sie eine äquivalente Probe aus der nicht induzierten Kontrollkultur.