Loop-vermittelte isotherme Amplifikation zur Nachweisung bakterieller Genen

0 Ansichten2:48 Min. • November 28th, 2025

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Nehmen Sie eine Mastermischung, die eine strängverdrängende DNA-Polymerase, Nukleotide und einen doppelsträngigen DNA-bindenden Farbstoff für eine schleifenvermittelte isotherme Amplifikation oder LAMP enthält.

Fügen Sie Primer hinzu, die eine umgekehrt komplementäre Sequenz enthalten, die spezifisch für das Ziel-Bakteriengen ist.

Verteilt den Mastermix in die Röhren.

Füge Proben mit bakterieller DNA-Vorlagen zu den Röhrchen hinzu.

Setze die Röhren in ein LAMPEN-Instrument.

Die anfängliche Denaturierung ermöglicht es dem Primer, an die Ziel-DNA zu binden.

Wenn die strängverdrängende DNA-Polymerase beginnt, einen neuen Strang zu synthetisieren, verdrängt sie den bestehenden Strang, wodurch ein thermischer Kreislauf überflüssig wird.

Das verstärkte Produkt bildet aufgrund der umgekehrt komplementären Paarung eine Schleifenstruktur.

Diese Struktur enthält mehrere Startstellen für den nächsten Zyklus, was die exponentielle Amplifikation der Ziel-DNA ermöglicht.

Der Farbstoff bindet an die amplifizierte DNA und strahlt Fluoreszenz aus.

Überwachen Sie die Fluoreszenz in Echtzeit, um das Vorhandensein des Zielbakteriengens in den Proben zu erkennen.

Trennen Sie die Bereiche, die zur Herstellung des LAMP Master Mix und zum Hinzufügen der DNA-Vorlagen verwendet werden, physisch.

Reinigen Sie die Arbeitsflächen mit Isopropanol und einer DNA- und DNase-abbauenden Lösung. Reinigen Sie dann die Pipetten und die Röhrenstreifenhalter. Taue den isothermen Master Mix, den 10-fachen Primer-Mix, molekulares Wasser, positive Kontroll-DNA und DNA-Vorlagen bei Raumtemperatur auf.

Schalten Sie das LAMP-Instrument ein und geben Sie die entsprechenden Beispielinformationen ein. Bereiten Sie die LAMP Master Mix gemäß den Manuskriptanweisungen vor, wirbeln Sie kurz und zentrifugieren Sie sie und verteilen Sie 23 Mikroliter der Master Mix in jede Öffnung eines Röhrenstreifens. Vortex alle DNA-Vorlagen und zentrifugieren Sie sie kurz.

Dann geben Sie zwei Mikroliter DNA-Vorlage in die entsprechende Mulde und schließen Sie die Mulde fest ab. Entferne den Röhrenstreifen vom Halter und schnippe ihn, um sicherzustellen, dass alle Reagenzien am Boden des Rohrs gesammelt sind. Lade den Röhrenstreifen in das LAMP-Instrument ein und starte den LAMP-Lauf.

Während die LAMP-Reaktion läuft, tippen Sie auf die Tabs Temperatur, Verstärkung und Anneal, um die dynamischen Veränderungen verschiedener Parameter während des LAMP-Laufs zu sehen.

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Zuletzt aktualisiert: 1 August 2026