Vorbereitung von Myxococcus-Xanthus-Proben für die Lebendzellbildgebung

Beginnen Sie mit einer Kultur von Myxococcus xanthus, einem langsam wachsenden Bodenbakterium.

Impfen Sie eine Kolonie in ein Medium, das mit einem Antibiotikum ergänzt wird.

Die Zellen wurden so konstruiert, dass sie dem Antibiotikum widerstehen, sodass nur die gewünschten Bakterien überleben.

Übertragen Sie die Suspension in eine größere Flasche mit dem Medium und inkubieren Sie sie mit Schütteln, um ein optimales Wachstum zu fördern.

Nehmen Sie einen Deckdeckel, der an einem Metallrahmen montiert ist und während der Bildgebung mechanische Unterstützung bietet.

Gib die Bakterienkultur darauf und füge dann fluoreszierende Mikrosphären hinzu, um als Referenzpunkte für die Bildausrichtung zu dienen, während mehrere Bilder aufgenommen werden.

Setzen Sie ein vorgewärmtes Agarose-Pad mit dem Medium und legen Sie es dann mit einem Deckdeckel darüber, um die Feuchtigkeit zu erhalten.

Inkubieren Sie, damit die Zellen am Agarose-Pad haften können.

Das Pad versorgt die Zellen mit Nährstoffen und ermöglicht so eine langfristige Bildgebung von Lebendzellen der zellulären Prozesse während der Proliferation des langsam wachsenden Bakteriums.

Zu Beginn wird eine einzelne M.xanthus-Kolonie in 500 Mikrolitern à 1 % CTT, ergänzt mit Antibiotika, in einem sterilen Schlauch wieder suspendiert und die gesamte Suspension in eine 50-Milliliter-Erlenmeyer-Flasche mit fünf Millilitern 1% CTT übertragen. Bereiten Sie eine 1%ige Agarosemikroskopielösung mit 0,2% CTT vor, indem ein Gramm Agarose mit 80 Millilitern TPM-Puffer und 20 Millilitern 1%-CTT-Medium gemischt wird. Die Lösung in der Mikrowelle aufwärmen, bis die Agarose geschmolzen ist.

Füllen Sie eine Petrischale mit etwa 60 Millilitern geschmolzener Agarose und lassen Sie sie auf Zimmertemperatur abkühlen. Erwärmen Sie das Agarose-Pad mindestens 15 Minuten vor der Anwendung bei 32 Grad Celsius vor. Als Nächstes legen Sie einen sterilen Glasabdecker auf einen Kunststoff- oder Metallrahmen mit einem Loch in der Mitte. Dann befestigt man den Deckmantel mit Klebeband am Rahmen.

Fügen Sie 10 bis 20 Mikroliter exponentiell gewachsener M.xanthus-Zellen auf den Deckmantel hinzu. Um fluoreszierende Mikrosphären als fiduziale Marker der Zellen hinzuzufügen, verwenden Sie einen TPM-Puffer, um die Mikrosphären auf 1:100 zu verdünnen. Schütteln Sie die Perlensuspension gründlich und geben Sie fünf bis zehn Mikroliter zu den Zellen.

Aus dem großen, vorgewärmten 1%-Agarose-Pad schneiden Sie ein kleines Pad von etwa der Größe des Deckels heraus und legen Sie es auf die Zellen. Dann legen Sie eine Abdeckung auf das Pad, um Verdunstung zu verhindern und die Zellen in einer feuchten Umgebung zu erhalten. Inkubieren Sie die Mikroskopieprobe bei 32 Grad Celsius für 15 bis 20 Minuten, damit die Zellen vor Zeitraffer-Mikroskopieaufnahmen am Boden des Agarose-Pads anhaften können.