Bewertung der schützenden Rolle eines säureaktivierten Chaperons bei E. coli unter Säurestress

Nehmen Sie rekombinante E.-coli-Kulturen , die empfindlich auf Umweltstress reagieren.

Die Testkultur enthält ein Plasmid, das für einen säureaktivierten Chaperon codiert, während die Kontrollkultur nur das Plasmid-Rückgrat besitzt.

Inokulieren Sie einzelne Kolonien in antibiotika-supplementierte Medien, um die Plasmidretention sicherzustellen, und inkubieren Sie, um das Bakterienwachstum zu fördern.

Verdünnen Sie die Kulturen in frischen Medien, die das Antibiotikum und einen Induktor enthalten, um die Expression des Chaperons zu aktivieren.

Wachsen Sie die Kulturen bis zur Mitte der Logaritma-Phase und verdünnen Sie dann, um eine bestimmte optische Dichte zu erreichen.

Fügen Sie Säure hinzu, um den pH-Wert zu senken und so Säurestress auszulösen.

In der Testkultur aktivieren saure Bedingungen das Chaperon, das zelluläre Proteine stabilisiert und ihre Aggregation verhindert. In der Kontrollkultur führt das Fehlen des Begleiters dazu, dass zelluläre Proteine denaturieren und aggregieren.

Gib eine Base hinzu, um den pH-Wert zu neutralisieren und den Säurestress zu stoppen.

Überwachen Sie das Bakterienwachstum, indem Sie die optische Dichte über die Zeit messen.

Das verstärkte Wachstum in der Testkultur zeigt die schützende Rolle des Begleiters während Säurestress.

Bereiten Sie eine Übernachtkultur in 50 Millilitern LB mit Ampicillin vor und kultivieren Sie die Zellen bei 200 U/min und 30 Grad Celsius. Verdünne Übernachtkulturen 40-fach in 25 Milliliter LB mit Ampicillin.

Wachsen Sie die Bakterien in Anwesenheit von 0,5 % Arabinose bei 30 Grad Celsius und 200 U/min bis zu einer optischen Dichte bei 600 Nanometern, oder OD₆₀₀ entspricht 1,0, um die HDEB-Proteinexpression zu induzieren. Für die pH-Verschiebungsexperimente verwenden Sie LB mit Ampicillin und Arabinose, um die Zellen auf einen OD₆₀₀ von 0,5 zu verdünnen. Passen Sie die jeweiligen pH-Werte an, indem Sie entsprechende Mengen von fünf molaren Salzsäuren hinzufügen.

Nach den angegebenen Zeitpunkten neutralisieren Sie die Kulturen durch Zugabe der entsprechenden Mengen von fünf molaren Natriumhydroxid. Überwachen Sie das Wachstum der neutralisierten Kulturen und der Flüssigkeitskultur 12 Stunden lang bei 30 Grad Celsius mittels OD-Messungen.