JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Mikrobiologie
0 Aufrufe • 3:17 Min. • November 28th, 2025
Beginnen Sie mit einem geschmolzenen, weichen Agar, der bei warmer Temperatur gehalten wird.
Inokulieren Sie eine Pseudomonas-Syringae-Kultur , den Teststamm, in den Agar.
Dann kurz vortexen, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen.
Gießen Sie die Mischung auf eine verfestigte Agarplatte und verteilen Sie sie gleichmäßig.
Schließen Sie den Deckel und lassen Sie ihn fest werden.
Entdecken Sie ein gefiltertes Supernatant auf der Oberfläche des erstarrten Agars.
Der Supernatant enthält Bakteriocin, ein antibakterielles Molekül, das aus einem stressinduzierten Spenderstamm P. syringae gewonnen wird.
Inkubieren Sie die Platte, um das bakterielle Wachstum und die Diffusion des Bakteriocins durch den Agar zu ermöglichen.
Das Bakteriocin bindet an spezifische Oberflächenrezeptoren des Teststamms und stört dessen Membran, was zum Zelltod führt.
Dies führt zur Bildung einer klaren Zone auf dem Agar, die den Bereich anzeigt, in dem der Teststamm durch das antibakterielle Molekül Bakteriocin abgetötet wurde.
Verdünne die Kultur von 1 bis 100 in frische KB. Inkubieren Sie die Kultur drei bis vier Stunden und schütteln Sie sie bei Zimmertemperatur. Anschließend bereiten Sie sterilisiertes Wasseragar vor, indem Sie eine Agarsuspension in ultrareinem Wasser autoklavieren.
Halten Sie den flüssigen, weichen Agar vor der Anwendung in einem 60-Grad-Wasserbad. Mit einer sterilen serologischen Pipette werden drei Milliliter Weichagar in ein steriles Kulturrohr übertragen. Bringen Sie den Kulturschlauch zurück ins Wasserbad, um ihn in einem geschmolzenen Zustand zu halten.
Lassen Sie den geschmolzenen Agar vor dem Gießen des Overlays abkühlen, aber nicht erstarren.
Es ist entscheidend, dass der Agar vor der Impfung in einem heißen, vollständig geschmolzenen Zustand gehalten wird. Wenn nicht, wirkt die Überlagerung körnig und schwerer zu interpretieren.
In einer sterilen Haube werden 100 Mikroliter der Teststammkultur in den weichen Agar und Vortex geimpft, um zu mischen. Drehen Sie die Kultur von Hand 10 bis 15 Sekunden und gießen Sie sie dann auf den Boden einer Agarplatte. Kippe die Platte in alle Richtungen, damit der weiche Agar den unteren Agar gleichmäßig bedeckt.
Decken Sie den Teller ab und lassen Sie ihn 20 bis 30 Minuten fest werden. Sei vorsichtig, die Platte beim Verstarren nicht zu stören. Sobald es verfestigt ist, geben Sie zwei bis fünf Mikroliter Supernatant auf die Schicht.
Lassen Sie die Platten über Nacht bei Zimmertemperatur inkubieren. Beobachten und notieren Sie die Ergebnisse am nächsten Morgen. Mit dieser Methode werden zwei Stämme von P. syringae von verschiedenen Bakteriocinen gehemmt. Stamm A ist empfindlich gegenüber einem hochmolekularen Bakteriocin, Tailocin, aber nicht empfindlich gegenüber einem alternativen, niedrigmolekularen Bakteriocin.