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Nehmen Sie eine Meerwasserprobe mit verschiedenen Mikroben, darunter umweltschädliche Bakterien.
Die Probe wird seriell verdünnt, um die mikrobielle Dichte zu reduzieren, und sie auf ein Nährmedium aufgetragen.
Nach der Inkubation werden morphologisch unterschiedliche Kolonien ausgewählt, die weiterhin genetisch und metabolisch vielfältige Bakterientypen beherbergen können.
Streaken Sie jede ausgewählte Kolonie, um einzelne Zellen zu verteilen und zu inkubieren.
Jede Zelle bildet eine Kolonie, die ein genetisch reines bakterielles Isolat mit einem eigenen Stoffwechselprofil darstellt.
Impfen Sie jedes Isolat in ein Wachstumsmedium und inkubieren Sie, um die Biomasse zu erhöhen.
Zentrifugiere die Kultur, entsorge das Supernatant und wasche mit einem Puffer, um das Restmedium zu entfernen.
Suspendieren Sie die Zellen im Puffer wieder und inokulieren Sie sie in ein Selektionsmedium, das EE2, einen Umweltschadstoff, enthält.
Als einzige Kohlenstoffquelle im Medium wählt EE2 Bakterien aus, die es für Energie und Wachstum metabolisieren können.
Trübung im Medium deutet auf Bakterienwachstum hin und bestätigt die Isolierung des schadstoffabbauenden bakteriellen Isolats.
Um Bakterien auszuwählen, führen Sie zunächst serielle Verdünnungen bis zu 10 bis minus neun in steriler Kochsalzlösung für Korallenproben und bis zu 10 bis minus sechs für Wasserproben durch. Die Pipette verdünnt fünfmal auf und ab, bevor die Spitze entsorgt wird.
Dann wirbeln Sie jeden einzelnen vortexen. Jedes Mal wirbeln die Proben fünf Sekunden lang, bevor die nächste serielle Verdünnung durchgeführt wird. Pipetten Sie 100 Mikroliter jeder Verdünnung auf Petrischalen mit 3 % Natriumchlorid-Lysogenie-Brühe, Agar-Medium und richten Sie diese an.
Inkubieren Sie die Platten ein bis drei Tage lang bei der Zieltemperatur, zum Beispiel bei 26 Grad Celsius. Überprüfe die Kennzeichen einmal am Tag. Wählen und isolieren Sie die Kolonien, wobei sie unterschiedliche Wachstumsmorphologien auf neuen Platten mit der Streak-Plate-Technik zeigen.
Wiederhole diesen Schritt so oft wie nötig, damit reine Kolonien auf den Platten wachsen. Lagern Sie die Isolate bei vier Grad Celsius oder in Glycerol, wie im Manuskript beschrieben. Um den EE2-Abbautest durchzuführen, nehmen Sie eine einzelne Kolonie aus den frischen Platten und inokulieren Sie in zwei Millilitern sterilem LB-Medium in einem Rohr.
Falls es ein Glycerol-Fond ist, nehmen Sie 10 Mikroliter Glycerol-Bakterien-Fond und streichen Sie es auf LB-Agarplatten. Inkubieren Sie über Nacht bei 24 bis 28 Grad Celsius, um einzelne Kolonien wachsen zu lassen. Setzen Sie das Rohr mit dem LB-Medium, das unter ständigem Rühren bei 150 x g bei 24 bis 28 Grad Celsius über Nacht steht.
Nach dem Bakterienwachstum pelletieren Sie die Zellen, indem Sie sie bei 8.000 x g für acht Minuten bei Zimmertemperatur zentrifugieren. Entsorge das Supernatant. Um die restliche LB-Brühe zu waschen, geben Sie zwei Milliliter Kochsalzwasser dazu, um die Zellen wieder aufzuhängen.
Wiederholen Sie das Waschen zweimal, um sicherzustellen, dass keine Spuren einer Kohlenstoffquelle vorhanden sind. Inokulieren Sie die gewaschenen und neu suspendierten Zellen in einem minimalen Bushnell Haas-Kulturmedium, das EE2 als einzige Kohlenstoffquelle enthält. Beurteile das Bakterienwachstum anhand der optischen Dichte bei 600 Nanometern und unserer Koloniebildungseinheiten auf LB-Agar-Medium nach 16 bis 72 Stunden Inkubation.