Name: Quantitative Messung der GLUT4 Translokation an die Plasmamembran mittels Durchflusszytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 39 s
Description: Erfahren Sie die quantitative Messung der GLUT4-Translokation an die Plasmamembran mittels Durchflusszytometrie in Säugetierzellen. Diese Methode ermöglicht die Analyse des Insulin-Effekts auf den Glukosetransporter.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Mrs. Clifford Elder Weiß Graham unterstützte Stiftungsprofessur Research Fund und die NIH (AR059838) zu CB, von der NIH (AR052791, AR044387-ARRA, &amp; NS063298) zu LTT, und von der Baylor College of Medicine Cytometry und Cell Sorting-Core mit Mitteln aus dem NIH (NCRR S10RR024574, NIAID AI036211, und NCI P30CA125123). Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des NIH.

1. Zellfärbung <ol><li> Bereiten Sie die Zellen. Die Zellen sollten verwendet werden, während immer noch aktiv wachsende (60 bis 80% Konfluenz) werden. Serum hungern die Zellen über Nacht, Teller ihnen Zellen bei 0,1 Millionen pro Well in 0,5 ml serum-freiem Medium in einer 24-Well-Platte und in den Inkubator (37 ° C, 5% CO 2) für 30 min - 2 Stunden zu erholen von Trypsinierung. </li><li> Mischen Sie die primären und sekundären Antikörper. Mix (5 ul des primären anti-GLUT4 Antikörper mit 1 ul sekundären Huhn anti-Ziege IgG-Antikörper, konjugiert mit AlexaFluor 488) x Anzahl der Brunnen. Inkubieren für 10 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. </li><li> Bereiten Sie eine 2X arbeiten Lager von Insulin durch Verdünnen in Medium. </li><li> Prüfen Sie, ob die Zellen eingehalten haben oder nicht. </li><li> Gently add 6 ul Antikörper-Mix und 0,5 mL von 2X arbeiten Bestand an Insulin, um den Brunnen mit den Zellen. Vermeiden Sie jegliche Turbulenzen des Mediums. Inkubieren (37 ° C, 5% CO 2) für 30 Minuten im Dunkeln. </li><li> Fix die Zellen durch Zugabe von 0,5 ml PBS + 1% PFA in jede Vertiefung, ohne Schütteln der Zellen. Inkubieren für 20 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. </li><li> Wenn Ihre Zellen in die Vertiefungen haften geblieben sind, heben sie mit einer Zelle Heber. Übertragen Sie die Zellen (1 ml gesamt) in Röhrchen, die in Ihrem Durchflusszytometer fit und Zentrifuge die Zellen zu pelletieren. </li><li> Waschen Sie die Pellet zweimal mit 1 mL PBS resuspendieren und in 0,4 ml PBS + 1% PFA. An dieser Stelle Zellen können in Folie gewickelt und im Kühlschrank aufbewahrt (4-8 ° C) oder getroffen werden, um das Durchflusszytometer für die sofortige Datenerfassung. </li></ol> 2. Data Acquisition <ol><li> Legen Sie ein breites Tor in die lebenden Zellen in der side scatter (SSC) versus forward scatter (FCS) Panel. Verwenden Sie einen negativen Rohr (Zellen, die nicht mit Insulin oder Zellen "befleckt" mit einem Isotyp-Kontrolle) behandelt, um Ihre FL1-Parameter. Vergewissern Sie sich, Gipfel ist vollständig in das Panel, nicht auf der unteren Seite abgeschnitten. </li><li> Erwerben Sie Daten von mindestens 10.000 Zellen pro Röhrchen. </li></ol> 3. Data Analysis <ol><li> Zeichnen Sie einen Schutzzaun um die lebenden Zellen in der SSC vs FSC-Panel (Abbildung 1A). Zeichnen Sie die Histogramme der AlexaFluor 488 Fluoreszenzintensität im Vergleich zur Anzahl von Zellen innerhalb des Live-cell-Tor (Abbildung 1B). Sie können Overlay verschiedenen Histogramme, um Unterschiede zu visualisieren, sondern für die Quantifizierung, die mittlere und die mediane Fluoreszenzintensität für jede Zelle Bevölkerung und der Nutzung dieser Nummern für Ihre Vergleiche (Abbildung 1C). </li><li> Normalisieren der Daten, um den Wert in Abwesenheit von Insulin erhalten, wie in den Abbildungen 1C und 1D gezeigt. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse In Myoblasten aus einem gesunden Menschen (keine Insulinresistenz) isoliert, induziert Insulin eine Dosis-abhängige Translokation von GLUT4 aus dem Zytoplasma an die Plasmamembran (Abb. 1, links). Im Gegensatz dazu wird Insulin nicht induzieren GLUT4 Translokation an die Plasmamembran von Myoblasten von einem Patienten mit Insulinresistenz (Abbildung 1, rechts) isoliert. <img src="/files/ftp_upload/2429/2429fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Beispiel für eine Färbung zu experimentieren. Myoblasten wurden von einem Spender, ohne Insulin-Resistenz (links) und von einem Patienten mit Insulinresistenz (rechts) isoliert. A, SSC (side scatter) versus FCS (forward scatter) Grundstück mit einem Tor in die lebenden Zellen. B, gated Cells in A, mit dem Antikörper gegen ein externes Epitop des GLUT4 gefärbt, und links unstimulierten (rot) oder mit Insulin stimuliert 1 nM (blau), 10 nM (orange) oder 100 nm (grün). Für Figur Klarheit, zeigen wir nur Daten ohne und mit 100 nM Insulin für die Zellen mit einer Insulinresistenz. C, mittleren Fluoreszenzintensitäten (MFI) der Histogramme in B gezeigt wurden, die MFI der Zellen normalisiert links unstimulierten (kein Insulin). D, Plots der normalisierten MFI Daten aus der Histogramme in B gezeigt

<ol><li>Zhao, F. Q., Keating, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+properties+and+genomics+of+glucose+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Functional properties and genomics of glucose transporters.</a> Curr. Genomics. 8, 113-128 (2007).</li>
<li>Karnieli, E., Armoni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+the+insulin-responsive+glucose+transporter+GLUT4+gene%3A+from+physiology+to+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of the insulin-responsive glucose transporter GLUT4 gene: from physiology to pathology.</a> Am. J. Endocrinol. Metab. 295, 38-45 (2008).</li>
<li>Graham, T. E., Kahn, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+alterations+of+glucose+transport+and+molecular+mechanisms+of+intertissue+communication+in+obesity+and+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Horm.+Metab.+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific alterations of glucose transport and molecular mechanisms of intertissue communication in obesity and type 2 diabetes.</a> Horm. Metab. Res. 39, 717-721 (2007).</li>
<li>Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD107a+as+a+functional+marker+for+the+identification+of+natural+killer+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity.</a> J. Immunol. Methods. 294, 15-22 (2004).</li>
<li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutellingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labeled+Annexin+V%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V.</a> J. Immunol. Methods. 184, 39-51 (1995).</li>
<li>Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+analysis+in+flow+cytometry%3A+the+future+just+started%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Data analysis in flow cytometry: the future just started.</a> Cytometry A. 77, 705-713 (2010).</li>
</ol>

Wir haben ein schnelles Verfahren zur Quantifizierung der Translokation von GLUT4 aus dem Zytoplasma an die Plasmamembran von Zellen mittels Durchflusszytometrie nachgewiesen. GLUT4 ist nur vorübergehend an der Plasmamembran von Zellen exprimiert wird und durch Endozytose. Da die gebundenen Antikörper an der GLUT4, auch während der Endozytose bleiben, gibt das Fluoreszenzsignal der Gesamtbetrag der GLUT4, die an der Plasmamembran während der gewählten Dauer der Inkubation in Gegenwart von Insulin ausgesetzt war. Diese Technik kann auch zur Untersuchung der Translokation von anderen Proteinen aus einem intrazellulären Kompartiment zur Plasmamembran angewandt werden, sofern eine gute Antikörper gerichtet an einen externen Epitop des Proteins von Interesse ist vorhanden. Zum Beispiel, ist ein ähnlicher Test jetzt häufig verwendet, um die Rate der Degranulation von zytotoxischen T-Lymphozyten und natürliche Killer-Lymphozyten durch die Messung der Translokation von CD107a ihrer Plasmamembran 4,5 zu bewerten. Die Translokation von Phosphatidylserin von der Innenseite der Plasmamembran auf die Außenseite während Apoptose oder Nekrose kann auch mittels Durchflusszytometrie detektiert werden, mit Fluorophor-markierten Annexin V 6. Neben Schnelligkeit des Tests präsentiert Durchflusszytometrie den Vorteil, dass die Untersuchung von Protein-Translokation an die Plasmamembran in gemischten Zellpopulationen. Tatsächlich kann man Färbung für Zell-Untergruppe Marker und für das Protein von Interesse, durch die Datenerfassung auf einem Multi-Laser-Durchflusszytometer 7 an zu kombinieren. Die Mengen von Antikörpern in Absatz 1.2 des Protokolls gegeben sind ein Ausgangspunkt, empfehlen wir Ihnen titrieren Ihre Antikörper mit Zellen von Interesse, um die minimale Antikörperkonzentration, die Ihnen ein maximales Signal zu bestimmen. Ein guter Ausgangspunkt Bereich für die Primär-Anti-Human-Antikörper GLUT4 wir hier verwendet haben würde 1-10 ul pro Röhrchen (dh 0,2-2 ug Antikörper pro Röhrchen), wobei jedes Rohr mit nicht mehr als 1 Million Zellen. Für andere primäre Antikörper, die Anweisungen des Herstellers beziehen. Die Normalisierung der Daten ist notwendig, da die Autofluoreszenz von Zellen vom Spender zum Spender und von Experiment zu Experiment variieren.

<table><tbody><tr><td>Antikörper gegen menschliches GLUT4</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-1606</td><td>Gerichtet gegen ein externes Epitop von GLUT4</td></tr><tr><td>Huhn-Anti-Ziege-IgG, konjugiert mit AlexaFluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21467</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes menschliches Insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2643</td><td></td></tr><tr><td>Zellabheber</td><td>VWR international</td><td>29942-118</td><td>Passend für die Vertiefungen zugeschnitten</td></tr><tr><td>5-ml-Röhrchen für FACS</td><td>VWR international</td><td>60819-138</td><td>Passend für alle BD-Geräte</td></tr></tbody></table>

quantitative messung der glut4 translokation an die plasmamembran mittels durchflusszytometrie

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glukose ist der wichtigste Energiequelle für den Körper, die eine konstante Regelung seiner Konzentration im Blut. Insulinfreisetzung der Bauchspeicheldrüse verursacht Glukoseaufnahme durch Insulin-sensitiven Geweben, vor allem das Gehirn, Skelettmuskel und Adipozyten. Patienten mit Typ-2-Diabetes und / oder Übergewicht entwickeln häufig eine Insulinresistenz und sind unfähig, ihre Glukose-Homöostase zu kontrollieren. Neue Einblicke in die Mechanismen der Insulinresistenz können neue Therapiestrategien bei Typ-2-Diabetes. Die GLUT-Familie Glucose-Transporter besteht aus dreizehn Mitgliedern auf verschiedenen Gewebe im gesamten Körper 1 verteilt. Glucose-Transporter Typ 4 (GLUT4) ist der wichtigste Transporter, vermittelt Glukoseaufnahme durch Insulin empfindlicher Gewebe wie die Skelettmuskulatur. Bei der Bindung von Insulin an seinen Rezeptor, Vesikel mit GLUT4 aus dem Zytoplasma transloziert zur Plasmamembran, induzieren Glukoseaufnahme. Reduzierte GLUT4 Translokation ist eine der Ursachen der Insulinresistenz bei Typ-2-Diabetes 2,3. Die Translokation von GLUT4 aus dem Zytoplasma an die Plasmamembran visualisiert werden können Immunzytochemie, mit Fluorophor-konjugierten GLUT4-spezifischen Antikörpern. Hier beschreiben wir eine Technik, um Gesamtmengen von GLUT4 Translokation an die Plasmamembran von Zellen in einem ausgewählten Zeitraum zu quantifizieren, mittels Durchflusszytometrie. Dieses Protokoll ist schnell (weniger als 4 Stunden, einschließlich der Inkubation mit Insulin) und ermöglicht die Analyse von so wenig wie 3.000 Zellen oder so viele wie 1 Million Zellen pro Bedingung in einem einzigen Experiment. Es stützt sich auf anti-GLUT4 Antikörper, die gegen einen externen Epitop des Transporters, die an sie bindet, sobald sie an die extrazelluläre Medium nach Translokation an die Plasmamembran ausgesetzt ist.

Dieses Protokoll beschreibt ein schnelles Verfahren, um die Translokation von GLUT4 aus dem Zytoplasma zu quantifizieren, um die Plasmamembran von Zellen mittels Durchflusszytometrie.

Quantitative Messung der GLUT4 Translokation an die Plasmamembran mittels Durchflusszytometrie

Glukose ist die Hauptenergiequelle des Körpers, was eine ständige Regulierung ihrer Blutkonzentration erfordert. Die Insulinausschüttung durch die Bauchspeicheldrüse induziert ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Translokation von GLUT4 in die Plasmamembran von Säugetierzellen als Reaktion auf Insulinexposition nachzuweisen. Serumverarmte Myoblasten, die ausschließlich intravesikuläres GLUT4-Protein enthalten, werden zunächst in einer 24-Well-Kulturschale ausgesät. Ein Antikörper gegen ein externes Epitop von GLUT4, der zuvor mit einem fluorophor-konjugierten sekundären Antikörper inkubiert wurde, wird dann den Zellen zugegeben, gefolgt von Insulin.Die Bindung an die Insulinrezeptoren an der Zelloberfläche führt zur Translokation von GLUT4 in die Plasmamembran. GLUT4 wird dann von Antikörpern im Medium erkannt. An diesem Punkt können die Zellen fixiert und die Intensität der fluoreszenten Färbung mittels Durchflusszytometrie gemessen werden.Diese Methode kann verwendet werden, um die Translokation von GGL4 und den Glukosestoffwechsel zu untersuchen, eignet sich aber auch für andere Systeme, beispielsweise die Degranulation natürlicher Killerzellen durch die Expression von CD107a an der Membran. Für dieses Verfahren ist es wichtig, Zellen zu verwenden, die sich aktiv teilen oder eine Konfluenz von 60 bis 80 % aufweisen, und die über Nacht serumfrei kultiviert wurden. Nach der Gewinnung der Zellen mittels Trypsin werden diese gewaschen und in regulärem Wachstumsmedium bei 200.000 Zellen pro Milliliter resuspendiert. Anschließend werden die Zellen in einer 24-Loch-Platte mit je 0,1 Millionen Zellen in 500 Mikroliter pro Loch ausgesät. Die Zellen werden dann eine Stunde bei 37 Grad Celsius inkubiert, um ihnen die Erholung von der Trypsin-Behandlung zu ermöglichen.Mischen Sie in der Zwischenzeit den primären Anti-Glute-Four-Antikörper und den mit Alexa Fluor 488 konjugierten sekundären Hühner-Anti-IgG-Antikörper im Verhältnis 5:1, berechnen Sie das benötigte Endvolumen unter Berücksichtigung, dass 10 Mikroliter der Antikörpermischung pro Vertiefung verwendet werden. Inkubieren Sie die Antikörpermischung 10 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Während die Antikörpermischung inkubiert, bereiten Sie eine zweifache Arbeitslösung von Insulin vor, indem Sie es in Wachstumsmedium auf die gewünschte Konzentration verdünnen.Nach einer Inkubationszeit von einer Stunde entfernen Sie die Zellen aus dem Inkubator. Geben Sie vorsichtig 10 Mikroliter Antikörperlösung in jedes Brunnenfeld mit Zellen. Stellen Sie sicher, dass mindestens ein Brunnenfeld unbehandelt bleibt.Diese negative Probe wird später zur Einstellung des Durchflusszytometers verwendet. Als Nächstes geben Sie 500 Mikroliter der zweifachen Insulin-Stammlösung in jede Vertiefung, um die Translokation von Glut4 an die Zelloberfläche auszulösen, und inkubieren die Platte 30 Minuten bei 37 Grad Celsius im Dunkeln. Nach Entnahme der Zellen aus dem Inkubator fixieren Sie diese, indem Sie je Vertiefung ein Milliliter PBS mit 1 % PFA hinzufügen, und inkubieren die Platte 20 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Mit einem Zellabheber lösen Sie vorsichtig die fixierten Zellen vom Boden der Vertiefungen ab und überführen sie jeweils von jeder Vertiefung in ein einzelnes FACS-Röhrchen.Zentrifugieren Sie die Röhrchen, um die Zellen zu pelletieren, dann wirbeln Sie sie erneut auf und resuspendieren sie in einem Milliliter PBS, um die Zellen zu waschen und erneut zu zentrifugieren; wiederholen Sie den Waschschritt zwei Mal. Verwerfen Sie das Überstand zwischen den Waschungen.Resuspendieren Sie die gewaschenen Zellen abschließend in 400 Mikrolitern PBS mit 1 % PFA. Die Zellen können nun auf die Oberflächenexpression von Glute vier im Durchflusszytometer analysiert werden. Sobald Sie mit Ihren Proben am Durchflusszytometer angekommen sind, beginnen Sie mit der Datenerfassung am nichtgefärbten Kontrollpräparat.Definieren Sie ein breites Lebendzell-Tor mithilfe der Parameter der Vorwärts- und Seitwärtsstreuung. Anschließend stellen Sie die Spannungseinstellung für den FL1-Kanal so ein, dass der negative Peak innerhalb der Grenzen des Histogramms sichtbar ist. Sobald diese Parameter festgelegt sind, messen Sie jede experimentelle Probe, wobei mindestens 10.000 Lebendereignisse pro Probe aufgezeichnet werden.Dieses Histogramm zeigt die Hochregulation der Oberflächen-Glut-Kraft-Färbung von Myoblasten, die 0,1, 10 oder 100 Nanomolar Insulin ausgesetzt waren. Im Gegensatz dazu versagen Myoblasten von insulinresistenten Individuen bei der Hochregulation von Glu Vier als Reaktion auf 100 Nanomolar Insulin. Wenn die mittleren fluoreszierenden Intensitäten stimulierter Zellen auf diejenigen unstimulierter Zellen normiert werden, ist ein direkter Vergleich der MFI-Werte gesunder und insulinresistenter Myoblasten möglich.Mithilfe dieses Verfahrens können Zellen für zusätzliche Oberflächen- oder intrazelluläre Marker gefärbt werden, um verschiedene Zellsubpopulationen in gemischten Populationen zu identifizieren.

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Forschung

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Biology

Biologie

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