Quantitative Messung der GLUT4 Translokation an die Plasmamembran mittels Durchflusszytometrie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Translokation von Gesäß vier zur Plasmamembran von Säugetierzellen als Reaktion auf die Insulinexposition nachzuweisen. Serumarme Myoblasten, die nur intravesikuläres GLUT 4-Protein besitzen, werden zunächst in einem 24 gut kultivierten Antikörper gegen ein externes Epitop der Schwemme plattiert. Vier mit einem Fluor vorinkubierte konjugierte Sekundärantikörper werden dann den Zellen zugesetzt, gefolgt von Insulin.

Die Aktivierung der Insulinrezeptoren an der Oberfläche der Zellen führt zu einer Translokation von Gesäß vier auf die Plasmamembranoberfläche. Gesäß vier wird dann durch Antikörper im Medium erkannt. An dieser Stelle können die Zellen fixiert und die Intensität der Fluoreszenzfärbung mittels Durchflusszytometrie gemessen werden.

Diese Methode kann zur Untersuchung der ggl-four-Translokation und des Glukosestoffwechsels verwendet werden, kann aber auch auf andere Systeme wie die NK-Zelldegranulation durch Exposition von CD 1 0 7 A an der Membran angewendet werden. Für dieses Verfahren ist es wichtig, Zellen zu verwenden, die aktiv wachsen oder zu 60 bis 80 % kofluent sind und über Nacht mit Serum ausgehungert wurden. Nach der Ernte der Zellen mit Trypsin waschen und resuspendieren Sie sie in normalem Wachstumsmedium bei 200.000 Zellen pro Milliliterplatte, die Zellen in einer 24-Well-Platte bei 0,1 Millionen pro 500 Mikroliter pro Well. Inkubieren Sie die Zellen dann eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius, damit sich die Zellen von Trypsin erholen können.

Mischen Sie in der Zwischenzeit den primären Anti-Gesäß-4-Antikörper und den konjugierten sekundären Hühner-Antigo-IgG-Antikörper Alexa Fluor 4 8 8 in einem Verhältnis von fünf zu eins, berechnen Sie das benötigte Endvolumen, wobei zu berücksichtigen ist, dass jeweils 10 Mikroliter der Antikörpermischung verwendet werden. Inkubieren Sie die Antikörpermischung 10 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln, während die Antikörpermischung inkubiert. Bereiten Sie einen doppelt so großen Vorrat an Insulin vor, indem Sie ihn auf die gewünschte Konzentration im Wachstumsmedium verdünnen.

Sobald die Zellen eine Stunde lang inkubiert haben, nehmen Sie sie aus dem Inkubator. Geben Sie vorsichtig 10 Mikroliter Antikörperlösung in jede Vertiefung, die Zellen enthält. Achten Sie darauf, mindestens eine Mulde fleckfrei zu lassen.

Diese negative Probe wird später für die Einrichtung des Durchflusszytometers verwendet. Geben Sie als Nächstes 500 Mikroliter des zweifachen Insulinvorrats in jede Vertiefung, um die Translokation von Gesäß vier auf die Zelloberfläche auszulösen, und inkubieren Sie die Platte 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius im Dunkeln. Nachdem Sie die Zellen aus dem Inkubator entnommen haben, fixieren Sie sie, indem Sie einen Milliliter PBS 1%PFA in jede Vertiefung geben und die Platte 20 Minuten lang inkubieren. Bei Raumtemperatur im Dunkeln lösen Sie die fixierten Zellen mit einem Zellheber vorsichtig vom Boden der Vertiefungen und übertragen sie aus jeder Vertiefung in ein einzelnes Faxrohr.

Zentrifugieren Sie die Röhrchen, um die Zellen zu pelletieren, dann in einem Milliliter PBS vortexen und resuspendieren, um die Zellen zu waschen und erneut zu zentrifugieren, wiederholen Sie den Waschvorgang. Treten Sie zweimal vor. Entsorgen Sie den Überstand zwischen den Wäschen.

Zum Schluss resuspendieren Sie die Waschzellen in 400 Mikrolitern PBS 1%PFA. Die Zellen können nun im Durchflusszytometer auf die Oberflächenexpression von Gesäß vier analysiert werden. Sobald Sie mit Ihren Proben am Durchflusszytometer angekommen sind, beginnen Sie mit der Erfassung von Daten aus der ungefärbten Kontrolle.

Definieren Sie ein breites Live-Cell-Gate mit den Parametern forward und side scattered. Passen Sie dann die Spannungseinstellung für den FL einen Kanal so an, dass die negative Spitze innerhalb der Ränder des Histogramms sichtbar ist. Sobald diese Parameter eingestellt sind, führen Sie jede experimentelle Probe aus, die mindestens 10.000 Live-Ereignisse pro Röhre aufzeichnet.

Dieses Histogramm zeigt die Hochregulierung der Oberflächenglutkraftfärbung oder der Myoblasten, die 0, 1, 10 oder 100 nanomolares Insulin ausgesetzt waren. Im Gegensatz dazu gelingt es Myoblasten von insulinresistenten Personen nicht, Glu vier als Reaktion auf 100 nanomolares Insulin hochzuregulieren. Wenn die mittlere Fluoreszenzintensität von stimulierten Zellen auf die von unstimulierten Zellen normalisiert wird, ist es möglich, die gesunden und insulinresistenten Myoblasten-MFIs direkt zu vergleichen.

Mit diesem Verfahren können Zellen für zusätzliche Oberflächen- oder intrazelluläre Marker gefärbt werden, um verschiedene Zelluntergruppen in gemischten Populationen zu identifizieren.