Kontinuierliche Überwachung biologischer Rauschen in Bakterien mittels Zeitraffermikroskopie

Beginnen Sie mit einer Kulturplatte, die Bakterien unter einem Agarose-Gelpad enthält, um die Bakterien zu immobilisieren und das Wachstum der Monoschicht zu unterstützen.

Die Bakterien exprimieren konstitutiv grünes fluoreszierendes Protein, was eine Echtzeitüberwachung der Genexpression ermöglicht.

Gießen Sie zusätzliches Agarosegel um das Pad, um die Probe zu versiegeln und sie bei Raumtemperatur feststellen zu lassen.

Versiegeln Sie die Platte mit Klebeband, perforieren Sie sie, um einen Gasaustausch zu ermöglichen, und wenden Sie sie um, um Kondensation zu verhindern.

Inkubieren Sie die Platte bei niedriger Temperatur, um das Gel zu stabilisieren und die Bakterienteilung zu verhindern.

Anschließend wird das Objektiv mit Immersionsöl aufgetragen und die Platte auf eine konfokale Mikroskopstufe gestellt.

Starten Sie Zeitrafferbildgebung.

Wenn GFP allmählich reift, beginnt es zu fluoreszieren. Während der Zellteilung werden diese fluoreszierenden Proteine auf die Tochterzellen verteilt, was zu einem Abfall der Fluoreszenzintensität führt.

Dies erzeugt ein sägezahnartiges Fluoreszenzmuster, und Unterschiede in diesem Muster zwischen genetisch identischen Zellen in derselben Umgebung zeigen biologische Störungen in der Genexpression.

Um die Proben abzubilden, nehmen Sie die Kolben aus dem Wasser und lassen Sie die Gellösung auf Körpertemperatur abkühlen. Gießen Sie drei Millimeter des Gels auf den Rand der Probeplatte. Wenn die Agarose erstarrt ist, versiegeln Sie die Platte mit Klebeband und stechen Sie mit einer 25-Gauge-Nadel mehrere Löcher in das Band.

Dann wird die Platte für mindestens 30 Minuten kopfüber bei vier Grad Celsius gelegt, damit die Agarose vollständig erstarrt und gleichzeitig eine Zellmitose verhindert wird. Innerhalb von 24 Stunden verwenden Sie ein Fluoreszenzkonfokalmikroskop, um die Probe mit der niedrigsten Vergrößerung zu lokalisieren und das automatische Fokussystem des Mikroskops einzuschalten. Öl auf das passende Ziel auftragen und mit dem Plattformregler die Platte vorsichtig verteilen.

Dann aktivieren Sie den automatischen Fokus erneut und folgen Sie dem Standardvorschlag für Z-Schritt-Querschnitte, um das Muster abzubilden.