Selektive Reinigung von Caenorhabditis-Würmern zur Anreicherung der Darmmikrobiota

Nehmen Sie eine Kulturplatte mit Caenorhabditis-Larven , die die Bakterien beherbergen, die ihren Darmlumen besiedeln.

Der Teller enthält einen bekannten bakteriellen Stamm als Nahrung. Verhungern Sie die Würmer, damit sie alle Bakterien aufbrauchen und in eine Ruhephase gelangen.

Gib ein Medium hinzu und übertrage die Würmer in ein Rohr.

Zentrifugiere und entsorge das Supernatant.

Fügen Sie eine Reinigungslösung hinzu, rühren Sie um, um oberflächenhaftende Bakterien zu entfernen, zentrifugieren Sie erneut und entsorgen Sie den Supernatanten.

Wiederholen Sie das Waschen und legen Sie die Würmer dann auf eine frische Kulturplatte.

Lassen Sie das Kriechen locker gebundene Nahrungsbakterien von der Oberfläche und dem Darmlumen entfernen, während die Bakterien, die den Darm stabil besiedeln, erhalten bleiben.

Wiederholen Sie den Transfer- und Crawling-Schritt, um die vollständige Entfernung der Lebensmittelbakterien sicherzustellen.

Fügen Sie das Medium hinzu, legen Sie die Würmer auf ein Uhrenglas und sezieren, um ihren Darm freizulegen.

Sezieren Sie die Därme, die die interessanten Bakterien enthalten, sammeln Sie sie in wassergefüllten Röhren und frieren Sie sie für die spätere Verwendung ein.

Um die Würmer auszuhungern und die Anzahl der OP50-1-Bakterien zu reduzieren, inkubieren Sie die Nematoden drei bis vier Tage bei 20 Grad Celsius. Gib 5 Milliliter des M9-Mediums auf die Platte der kürzlich ausgehungerten Würmer und übertrage dann das M9-Medium und die Würmer in ein steriles 15-Millimeter-Zentrifugenrohr, um es bei Raumtemperatur für 30 Sekunden bei 1.000-fachem g zu drehen.

Entfernen Sie das Supernatant vor dem Waschen der Würmer fünfmal mit 10 Millilitern M9 mit 0,05 % Triton X-100 auf einem Nutator für 20 Minuten. Nach der letzten Wäsche wird das Überlagerungsmittel in 100 Mikrolitern Lösung ohne Störung entfernt und das M9 sowie die Würmer auf eine ungesäte 6-Zentimeter-NGM-Platte übertragen. Lass den Teller 20 Minuten trocknen, während die Würmer herumkrabbeln, um OP50-1 aus der Nagelhaut und dem Darm zu entfernen.

Wenn die Platte trocken ist, wiederholen Sie das Verfahren, indem Sie 250 Mikroliter M9 hinzufügen und die Würmer auf eine neue, ungesaatete 6-Zentimeter-NGM-Platte übertragen, damit die Würmer kriechen können, während die Platte trocknet.

Nach 20 Minuten geben Sie 250 Mikroliter des M9 auf die Platte und übertragen 100 Mikroliter des M9 zusammen mit Würmern auf ein sauberes Uhrglas.

Dann enthaupten Sie die Nematoden mit einer 26-Gauge-Spritznadel, während Sie den Wurm mit einer weiteren 26-Gauge-Spritznadel festhalten.

Nach der Enthauptung weichen der Darm, eine körnige Masse und die transparente Gonade natürlich vom Nematodenkörper ab, schneiden dann ein Stück des freiliegenden Darms ab und übertragen einen einzelnen dissektionierten Darm in ein 0,5-Milliliter-PCR-Rohr mit 10 Mikrolitern sterilem Wasser. Wiederholen Sie das Verfahren, um Därme von mindestens fünf verschiedenen Tieren in PCR-Röhren zu entnehmen.

Kühlen Sie die PCR-Röhren mindestens 5 Minuten bei minus 80 Grad Celsius ein. Tauen Sie die Darmproben auf, bevor Sie mit der PCR und der Sequenzierung zur Identifizierung fortfahren.